体外分析应用PPT课件.ppt

1 体外分析技术 二 2 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析 pg mL ng mL mg mL mg mL g L 免疫分析 TherapeuticDrugs ThyroidHormone FertilityHormone Allergy CancerMarkers InfectiousDisease Vitamins SerumProteins 常量 微量 超微量 3 体外分析技术 体外放射分析 体外非放射分析 放射性竞争结合分析 放射性非竞争结合分析 放射免疫分析 radioimmunoassay RIA 免疫放射分析 酶免疫分析 化学发光免疫分析 荧光免疫分析 immunoradiometricassay IRMA EIA CLIA FIA 一 分类 1 放射免疫分析技术 放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性 精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术 放射免疫分析 radioimmunoassay RIA 以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量 免疫放射分析 immunoradiometricassay IRMA 以过量标记抗体与抗原非竞争结合 采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体 1 放射免疫分析技术 优点 超微量分析技术 具有很高的精密度 灵敏度和准确度缺点 反应条件要求一般 但该技术所用标记物有放射性 对人体有一定的危害 实验人员应加强防护 同时试剂半衰期较短 试剂必须在半衰期内用完 否则试剂会作废 这需要科学地做好试剂计划 另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素 使灵敏度受到限制 2 酶标记免疫分析技术 是用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子 进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术 酶联免疫吸附分析法 ELISA 现在被广泛应用于实验诊断中 原理 在抗体上连接酶分子 进行夹心法免疫反应 反应结束后 将结合的复合物和游离抗体分开 取结合部分 利用酶的催化活性 由结合部分上的酶将特定的底物转化为特定的颜色 利用分光光度计测定 颜色的深浅与酶的量呈正比 而酶的量又和复合物的量呈正比 由此得到待测物的量 常用的酶是辣根过氧化物酶常用的底物是四甲基联苯胺 2 酶标记免疫分析技术 优点 普通的分光光度计就可以工作 仪器的灵敏度较放免仪有所降低 但酶分子可形成大量有色产物 会对灵敏度有所补偿 因此ELISA法也具有很高的灵敏度 同时本方法没有应用放射线 避免了放射线对人员的危害 缺点 可能会出现 倒钩 现象 使实验出现假阴性或抗原 抗体的实际含量减低 另外 ELISA法实验是一次性的 显色反应往往需要在一定时间内读数 无法重复测量 3 时间分辨荧光免疫分析技术 原理 待测物通过免疫反应形成的复合物上带有镧系元素 常用铕元素 铕元素经紫外线激发后会发出长波荧光 在免疫反应结束后需向反应体系中加入一个 荧光增强剂 提高荧光强度 上述激发可以反复激发 这就大大增强信号强度 反应过程直到荧光衰减到很低水平 停止记录 荧光强度与待测物的浓度相关 通过计算机数据处理系统可以给出待测物的浓度 标记物 由镧系元素通过一定的连接剂与抗体蛋白相连而组成 3 时间分辨荧光免疫分析技术 优点 信号强 测量时间短 具有较高灵敏度 缺点 标记物和荧光增强剂制备难度大 且荧光增强剂含一定有毒物质 废物应该严格处理 4 化学发光免疫分析技术 免疫化学发光分析技术 chemiluminescenceimmunoassay CLIA 化学发光酶免疫分析技术 chemiluminescenceenzymeimmunoassay CLEIA 电化学发光免疫分析技术 electrochemiluminescenceimmunoassay ECLIA 4 化学发光免疫分析技术 免疫化学发光分析技术用吖啶酯直接标记抗体 抗原 与待测标本中相应的抗原 抗体 发生免疫反应后 形成固相包被抗体 待测抗原 吖啶酯标记抗体复合物 这时只需加入氧化剂和pH纠正液成为碱性环境 吖啶酯即可在不需要催化剂的情况下分解 发光 由集光器和光电倍增管接收 记录单位时间内所产生的光子能 这部分光的积分与待测抗原的量成正比 可从标准曲线上计算出待测抗原的含量 4 化学发光免疫分析技术 发光 Y Y Y 磁微粒 被测抗原 抗体 带丫啶酯标记物抗体 冲洗后 1 加入H2O2 pH 10 2 加入碱 pH 10 4 化学发光免疫分析技术 化学发光酶免疫分析技术用参与催化某一化学发光反应的酶来标记抗原或抗体 在与待测标本中相应的抗原 抗体 发生免疫反应后 形成固相包被抗体 待测抗原 酶标记抗体复合物 经洗涤后 加入底物 发光剂 酶催化和分解底物发光 由光量子阅读系统接收 光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大 再把它们传送至计算机数据处理系统 计算出测定物的浓度 标记物发光剂辣根过氧化物酶 HRP 鲁米诺碱性磷酸酶AMPPD 辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 4 化学发光免疫分析技术 电化学发光免疫分析技术以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体 抗原 以三丙胺 TPA 为电子供体 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应 它包括电化学和化学发光两个过程 电化学发光免疫分析示意图 4 化学发光免疫分析技术 相比于其他标记免疫技术的优势 1 灵敏度高 特异性强 可实现ng甚至pg级微量待检物质的定量检测 单克隆技术的完善为检测的特异性提供了良好的保证 2 线性范围宽 可满足103 106数量级内的绝对定量检测需要 保证了临床应用中的简便性 避免了实验中的稀释误差 3 标记物稳定 试剂有效期长 商业化的化学发光免疫中的标记物稳定 试剂一般均可达1年以上的有效期 4 自动化程度高 检测菜单齐全 方便临床应用 大大提高了临床检测的稳定性 几种标记 检测技术灵敏度的比较 酶标 荧光 放免 发光 灵敏度 mol L 10 1810 1510 1210 9 几种标记 检测技术线性范围的比较 酶标 荧光 放免 发光 线性范围 105104103102 几种标记 检测试剂的有效期比较 酶标 荧光 放免 发光 有效期 月 1815129630 三种免疫测定技术的成本及费用 三种免疫测定技术的成本及费用 放免 酶标 发光 统计方法分析放射免疫分析与化学发光技术各自优劣 如四格表卡方检验分析灵敏度 特异性 阳性预测值 阴性预测值 思考 二 肿瘤标志物及其临床意义 目前尚未发现100 特异性和100 灵敏度的肿瘤标志物 肿瘤与肿瘤标志物之间不是一一对应关系 它们只是相关性 理想的肿瘤标志物 特异性100 灵敏度100 器官特异性与肿瘤大小或分期有关能进行疗效观察与预后有关可靠的预测价值 肿瘤的发生发展 正常组织细胞 间变 恶性变 肿瘤细胞 不可见前期 3mm 肿瘤标志物异常 可见前期 3mm 影像学异常 肿瘤的发展及诊断期 肿瘤标志物在全球的应用情况 肿瘤标志物的分类 化学特性 癌胚抗原类标志物糖类抗原标记物酶类标志物激素类标志物癌基因其他 肿瘤与肿瘤标记物 相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上CA19 9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定 MUC 1 MUC 3 Baeckstrometal 1992和1995 涎腺蛋白 Baeckstrometal 1995 颌下腺粘蛋白支气管肺泡粘蛋白 不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上在肿瘤细胞株中CA199 CA50和CA242共同表达于MUC 1和诞腺蛋白中 Baeckstrometal 1992 肿瘤标志物基本上不能对肿瘤定位 极少数肿瘤标志物如PSA PAP 酸性磷酸酶 甲状腺球蛋白具器官特异性 但不具肿瘤特异性 通常不能进行确诊 因为肿瘤标志物无足够的灵敏度 不能排除假阴性结果 本周蛋白 多发性骨髓瘤 AFP 肝癌 HCG 绒毛膜癌 和降钙素 甲状腺C 细胞癌 等有助确诊 临床常用肿瘤标志物的组合 临床常用肿瘤标志物的组合 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 甲胎蛋白是在胎儿血清中发现的一种转移性的甲种球蛋白 AFP主要由胚胎卵黄囊 胚胎肝细胞及其他内胚层分化的胃肠组织合成 卵巢癌等患者AFP水平升高 68 92 卵黄囊肿瘤患者也可见血清AFP上升 此外 胃癌 结直肠癌 胰腺癌 肺癌等均可发现AFP水平升高 但是升高水平均不及原发性肝癌患者 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 癌胚抗原属于非器官特异性肿瘤相关抗原 首先从胎儿及结肠癌组织中发现 分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器 如胃肠道 呼吸道 泌尿道等 正常情况下 CEA经胃肠道代谢 而肿瘤状态时的CEA则进入血清和淋巴循环 引起血清CEA异常增高 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 2 乳腺癌 腺胰癌 胆管癌 胃癌 食道癌 肺癌和泌尿系肿瘤等 阳性率50 70 1 原发性结肠癌患者 CEA升高者占45 90 3 术后CEA持续阳性 说明手术切除不完全或癌肿发生转移 提示病人预后较差或有复发的可能 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 5 由于吸烟会影响血清CEA值 应用CEA作为辅助临床诊断时 需根据病人的症状 体征 其他检验结果 做出正确的诊断 4 良性肿瘤 炎症和退行性疾病 如结肠息肉 溃疡性结肠炎 胰腺炎和酒精性肝硬化病人CEA也有部分升高 但远远低于恶性肿瘤 一般小于20 g L 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 CA15 3是一种多形态上皮糖蛋白 为乳腺癌患者术后复发的最佳指标 妊娠三个月的孕妇可见中等程度升高 CA15 3存在于多种腺癌内 如乳腺癌 肺癌 胰腺癌及卵巢癌等 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 癌抗原CA125属于一种与上皮性卵巢癌相关的高分子糖蛋白 表达于胚胎体腔上皮组织 存在于上皮性卵巢癌组织和病人的血清中 CA125主要用于辅助诊断恶性浆液性卵巢癌 上皮性卵巢癌 同时也是卵巢癌术后 化疗后疗效观察的指标 应持续动态的观察 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 2 健康人群中的鳞状细胞恶性肿瘤的早期筛查 1 子宫颈癌 肺癌 食道癌 头颈部肿瘤和外阴部肿瘤的诊断 手术或放化疗前后的疗效观察及复发预测 人附睾上皮分泌蛋白4 HE4 CYFRA21 1是细胞角蛋白19 cytokeratins 的可溶性片段 目前主要用做肿瘤标志物 对肺癌的诊断有较大意义 是检测非小细胞肺癌的首选肿瘤标志物 此外 CYFRA21 1的浓度升高也可见于乳腺癌 食管癌和头颈癌等 前列腺特异性抗原 PSA prostatespecificantigen PSA 是前列腺的特异性标记物属于器官特异性抗原 不具备肿瘤特异性PSA属于酶类肿瘤标记物 具有糜蛋白酶样和胰蛋白酶的活性PSA在正常男性含量小于4 g L 游离f PSA在正常男性含量小于1 g L前列腺癌 前列腺增生 前列腺炎和前列腺损伤都会导致血清PSA升高血清PSA在男性其他正常组织中和患其他癌肿时血清PSA都不会升高 肿瘤标记物的临床意义 一般人群筛选 有限在有症状的人群中作辅助诊断 可以肿瘤分期 有限预测预后 可以监测治疗效果 可以追踪疾病的复发 可以 三 性激素相关指标 激素分类 蛋白激素促性腺激素释放激素 GnRH 促黄体激素 LH 促卵泡激素 FSH 人绒毛膜促性腺激素 hCG 抑制素 Inhibin 泌乳素 Prolactin 类固醇激素雌性激素雌酮 E1 雌二醇 E2 雌三醇 E3 孕酮雄性激素睾酮双氢睾酮 DHT 雄烯二酮雄酮脱氢表雄酮 DHEA 硫酸脱氢表雄酮 DHEA S 生殖内分泌激素的检测 内分泌失调疾病的诊断和管理儿童时期青春期成年期绝经期和更年期不育和辅助生殖胎儿健康 性激素常用检测菜单 妊娠相关激素人绒毛膜促性腺激素 hCG 内分泌状况评估性激素六项促黄体激素 LH 促卵泡激素 FSH 泌乳素 Prolactin 孕酮睾酮雌二醇 E2 唐氏三联筛查甲胎蛋白 AFP 人绒毛膜促性腺激素 hCG 雌三醇 E3 肾上腺皮质功能评估硫酸脱氢表雄酮 DHEA S 人体绒毛膜促性腺激素 hCG 人体绒毛膜促性腺激素 hCG 是一种由胎盘产生的 结构与垂体激素FSH TSH和LH类似的糖蛋白激素 这些激素都含有相同的 亚单位 MW15000 20000道尔顿 但 亚单位不同 造成各自免疫学和生物学上的特异性 hCG 功能在怀孕早期维持黄体分泌功能促使胎儿性腺的发育促使胎儿胎盘产生类固醇激素 hCG是怀孕的一种很好的标志物 健康个体和非孕个体的hCG水平很低 5mIU mL IU L 甚至无法检测 怀孕期的hCG浓度上升 头三个月过后逐渐下降 水平异常低或异常地急剧下降表示可能存在异常情况 比如宫外孕或即将自然流产 hCG的临床应用 怀孕检测监测怀孕状况在最初的8周内水平成几何级上升在第2个三个月内水平下降峰值的90 在第3个三个月内水平保持恒定宫外孕的诊断诊断滋养层和睾丸肿瘤唐氏综合症的产前筛查 泌乳刺激素 PRL 泌乳刺激素 PRL 是一种单链多肽 由脑下垂体腺的前细胞分泌 丘脑下部主要通过释放催乳素抑制因子 多巴胺 和催乳素释放因子 五羟色胺 来控制泌乳素的分泌 PRL的主要生理功能 激发和维护妇女的哺乳期 是乳房正常发育和妇女哺乳期的必需条件 产后和新生儿的泌乳素水平升高 泌乳素的临床应用 水平升高下丘脑 垂体功能亢进 高于200ng ml高度怀疑垂体瘤男性乳房发育创伤 术后肾衰原发性甲状腺机能减退水平下降 垂体功能低下 席汉氏综合征等 黄体生成素和卵泡刺激素 LH和FSH 靶器官 垂体 下丘脑 LHFSH 男性 促性腺激素释放激素 女性 促性腺激素释放激素 LHFSH 类固醇激素产生睾酮 类固醇激素产生雌二醇孕酮 类固醇抑制素 类固醇抑制素 人促黄体激素 hLH 促黄体素 人促黄体激素 人体促卵泡激素均由两个不同的糖蛋白亚单位组成 女性体内的hLH刺激卵泡的最终成熟 卵泡的分裂及排卵 hFSH促卵泡的生长 和hLH联合激发雌性激素的分泌和排卵 临床应用 一般通过测定hLH与hFSH的浓度对月经周期 生育及诸如早发性卵巢衰竭 绝经 排卵紊乱和垂体衰竭等青春期发育异常现象进行检查hLH hFSH的比率也被用来帮助诊断多囊卵巢疾病 低浓度hLH和hFSH可能表明垂体衰竭浓度升高的hLH和hFSH及浓度降低的性腺类固醇则可能表明性腺衰竭 绝经期 卵巢切除术 早发性卵巢综合征 Turner综合征 LH和FSH的临床应用 临床意义青春期发育迟缓或早熟无月经多囊性卵巢综合症原发性卵巢衰竭原发性女性机能亢进不育的评估辅助生殖技术FSH基线值绝经期 孕酮 孕酮主要是通过黄体产生 是雌激素 睾酮 和所有男性激素和其它肾上腺激素的前体物质功能子宫内膜的增生以备受精卵着床确保胎儿存活天然的抗抑郁药帮助恢复正常的睡眠模式帮助保持对胰岛素的控制保护和防止纤维囊性乳房 AdaptedfromTheHormoneSolutionbyErikaSchwartz M D 孕酮的临床应用 生殖评估诱发排卵效果的评估了解黄体功能状况怀孕的 风险 监测在怀孕早期检测黄体不足宫外孕可能性的指标孕酮替代治疗的监测 雌二醇 雌二醇的水平有助于监测排卵的情况 因为雌二醇水平反映了卵泡成熟度 雌二醇的测定对于分析性发育状况 无月经病因 不孕和绝经的成因都很有价值 男性的雌二醇水平异常高表明有女性化综合症 比如 男性乳房发育 雌二醇的临床应用 区别诊断无月经在女孩中评估青春期早熟在男性中评估男子女性乳房 雌三醇 母体血清中的未结合雌三醇主要是由胎儿肝和胎盘分泌的雌三醇测定游离形式的血清水平 可提供胎儿健康和胎盘功能的灵敏指标 非结合雌三醇的临床应用 母血雌三醇胎儿健康和胎盘功能的敏感指标在正常的怀孕过程中水平通常会升高 睾酮 类固醇激素男性主要性激素睾丸的生精细胞分泌女性为雌性激素提供前生物质由卵巢 肾上腺和外周的脂肪组织分泌产生血循环中的睾酮主要和性激素结合球蛋白 SHBG 和白蛋白结合只有4 为游离状态 睾酮的临床应用 男性的临床应用水平降低性腺机能减退垂体机能减退Kleinfelter s综合症肾衰肝硬化水平升高肾上腺和睾丸肿瘤先天性肾上腺增生异常的下丘脑 垂体 睾丸轴 睾酮的临床应用 女性的临床应用水平升高多囊性卵巢综合症原发性无排卵的原因卵巢和肾上腺肿瘤先天性肾上腺增生下丘脑 垂体 卵巢轴的失调 硫酸脱氢表雄酮为肾上腺类固醇激素由肾上腺分泌产生 硫酸脱氢表雄酮 DHEA S 硫酸脱氢表雄酮 DHEA S 可代谢为 活化 的雄性激素睾酮雄烯二酮半衰期长 每日变化少随年龄增加水平降低 70岁 只有高峰时的10 20 硫酸脱氢表雄酮 DHEA S 的临床应用 肾上腺皮质功能的指标区别诊断多毛症 不正常毛发生长 男性化现象 女性男性化 多囊性卵巢疾病肾上腺肿瘤库辛氏综合症 广泛开展的产前筛查 孕中期第15 22周筛查 组合测试主要包括 AFP TotalhCGAFP Freeb hCGAFP Totalb hCG uE3AFP Totalb hCG uE3 Inhibin AAFP Totalb hCG uE3 NAPTotalb hCG Freea hCG Progesterone 预测风险ONTD 开放性神经管缺陷Trisomy21 唐氏综合症Trisomy18 爱德华氏综合症 胎儿健康应用法则 血清样品 AFP升高hCG正常uE3正常 AFP下降hCG升高uE3下降 AFP下降hCG下降uE3下降 怀疑ONTD 怀疑Trisomy21 怀疑Trisomy18 羊水诊断 超声波确认孕周 错误的孕周 确认孕周 重新计算或重新抽血 重复 超声波结合或不结合羊水诊断 TC Soft BCI产前筛查领域战略伙伴提供孕中期两联 三联 四联临床计算软件来评估胎儿风险 基于实验室测试 AFP hCG和雌三醇 Inhibin A 母亲年龄孕周其它标准 如 胎儿数量 身高体重 糖尿病等全中文 中国人的数据库可与Access LXi DxI系统相连接接受国内专业权威指导和评估 性激素常用检测菜单 妊娠相关激素人绒毛膜促性腺激素 hCG 内分泌状况评估性激素六项促黄体激素 LH 促卵泡激素 FSH 泌乳素 Prolactin 孕酮睾酮雌二醇 E2 唐氏三联筛查甲胎蛋白 AFP 人绒毛膜促性腺激素 hCG 雌三醇 E3 肾上腺皮质功能评估硫酸脱氢表雄酮 DHEA S 四 骨质疏松相关指标 82 骨质疏松症定义 一种全身骨代谢障碍的疾病 其实质为骨组织显薇结构受损骨矿成分比例减少骨质变薄 骨小梁数量减少导致骨脆性增加 骨折风险升高临床表现患者臀部 脊柱 腕部易骨折与年龄相关 女性多发于男性 83 102030405060708090 年龄 生长期 缓慢丢失 持续丢失 快速丢失 绝经期 骨丢失速率 骨密度 骨峰值 骨折阈值 骨质疏松症发病率 84 BoneMarker骨代谢标志物 85 骨形成标志物N MIDOsteocalcin N 端骨钙素 P1NP 总1型原胶原氨基端延长肽 参与骨形成的标志物25 OH VitaminD3 25 羟维生素D3 PTH 甲状旁腺素 骨吸收标志物 crosslaps CTX 胶原降解产物与骨质疏松相关的标志物激素 主要骨标志物介绍 86 N MIDOsteocalcin OC N 端骨钙素 生物学特性 骨合成过程中由成骨细胞产生VitK依赖性 49个氨基酸组成 分子量约为5 8KD骨基质中最重要的特异性非胶原钙结合蛋白 87 临床意义 反映成骨细胞功能的特异标志物血清 血浆 含量异常 多见于骨质疏松原发 继发性甲状旁腺功能亢进Pag