05 真核生物的遗传分析.doc

第五章 真核生物的遗传分析第五章 真核生物的遗传分析教学目的和要求：1. 理解四分子分析的原理和遗传作图的方法；2. 了解真核生物重组的机制3. 掌握各种遗传标记的特点及应用。教学重点和难点：【教学重点】1. 四分子分析的原理和遗传作图的方法；2. 重要分子标记分析原理和方法。【教学难点】应用四分子分析进行遗传作图的原理与方法；重要分子标记分析原理与具体实验环节之间的有机联系。教学内容：第一节 真菌类的染色体作图一两个连锁基因的作图二三个连锁基因的作图三红色面包霉染色体的着丝粒作图第二节 真核生物重组的分子机制一同源重组的发生二同源重组的分子模型三有丝分裂分离与重组第三节 基因转变及其分子机制一. 异常分离与基因转换二. 基因转变及其分子机制 第四节 真核生物遗传标记的特点及应用一. RFLP标记二. VNTR和STR标记三. SNP标记 四. 分子标记遗传图谱的应用第一节 真菌类的染色体作图除了二倍体的高等植物具有连锁和交换的遗传现象以外，单倍体的真菌也有连锁和交换的遗传现象。对单倍体真菌的遗传分析和染色体作图通常采用四分子分析（tetrad analysis）的方法。一次减数分裂的四个子细胞称为四分子，对四分子进行遗传学分析称为四分子分析。根据减数分裂产物在子囊中排列是否有序将四分子分析可分为有序四分子分析和无序死分子分析两种。有序四分子分析是指根据一个子囊中四个按严格顺序直线排列的四分子表现进行的遗传分析，也称为有序四分子分析。无序四分子或八分子中孢子没有特殊的顺序，因此也就不能进行着丝粒作图，但无序四分子也可用于各种减数分裂分离和重组分析。前者以对粗糙链孢霉(Neurospora crassa，2n14)的遗传分析为代表，而后者主要是对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 2n34)的遗传分析。粗糙链孢霉，又称红色面包霉，在分类学上属于真菌中的子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属，目前已知有45种。利用粗糙链孢霉进行遗传学分析有如下优点：个体小，生长快，容易培养；既可进行有性繁殖，又可进行无性繁殖，一次杂交可产生大量后代；染色体与高等生物一样，研究结果可广泛应用于遗传学上；无性世代是单倍体，没有显隐性，基因型可以直接在表型上反映出来；一次只需分析一个减数分裂的产物，就可以观测倒遗传结果，简单易行，而二倍体合子是两个不同减数分裂产生的配子相互结合的结果，需要通过测交实验才能分析减数分裂的结果，手续麻烦。因此粗糙链孢霉是进行基因分离和连锁交换遗传分析的好材料。粗糙链孢霉的营养体是由单倍体（n7）的多细胞菌丝体和分生孢子所组成，生活方式由有性和无性两种。菌丝经有丝分裂直接发育成菌丝体，称无性生殖。而两种不同接合型细胞结合产生有性孢子的过程称有性生殖。 无性繁殖过程，由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中只含有一个核，大型分生孢子有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可以再生成分生孢子，周而复始。酿酒酵母（n=17）的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞（酵母的优势形态）也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能够进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。酵母有两种交配类型，称作a和，是一种原始的性别分化，因此很有研究价值。一两个连锁基因的作图酿酒酵母、构巢曲霉和单细胞藻类中的衣藻的每一个子囊中的8个子囊孢子的排列是杂乱无序的。这类真菌的遗传分析可采用非顺序四分子分析(unordeted tetrad analysis)方法。以酿酒酵母为例，如果要研究A、B基因是否连锁，并计算图距。首先要明了当ABab杂交时，无论有无连锁，只产生下列3种可能的无序四分子。因为这些子囊是无序排列的，所以尽管第一种类型(亲二型)看起来似乎是两个座位都同M模式，实际上不是这样，这些孢子以任意顺序写出来都是等效的。这些子囊仅仅是按照它们是包含二型(ditypes)还是四型(tetratypes)来划分的。在二型中，两种基因型要么是亲二型(PD)要么是非亲二型(NPD)，四型子囊则是由T所表示的。我们可以试着写一些子囊，证明除了PD、NPD和T之外，没有别的子囊型。观察这3种子囊类型(即四分子类型)，可以发现只有NPD和T有重组型，故这两种四分子类型是决定重组频率的关键。由于T只有巨12重组型，所以当我们已知NPD及T的百分数后，用下列公式求：若求出RF=0.5，可以断定A、B基因无连锁。如果RF0.5，则两基因座连锁。并可以用这个百分数表征其图距。如本章先前所述，这个RF值也可能低估了图距，其原因仍然是没有考虑双交换和多交换的缘故。当然，PD、NPD和T的频率可用于校正双交换。首先，我们要了解PD、NPD和T的四分子类型是如何在连锁的标记基因的杂交中形成的。假设基因a、b连锁，如果在减数分裂过程中a、b间可以发生非交换(no crossovers，NCO)、单交换(single crossover, SCO)或双交换(double crossovers,DCO)。用图表示减数分裂形成的这些无序子囊。应注意到NPD是四线双交换产物。如果假设双交换在4条染色单体间随机发生。因此，可以推论4个DCO的频率是相同的。这就意味着NPD类型包括了1/4的DCO，则可以表示为：DCO=4NPD。单交换也可以用同样方法计算。注意到T型四分子既可来自单交换(SCO)，也可来自双交换(DCO)。但我们可以估计T型中来自DCO减数分裂的部分是2NPD，故SCO的大小可以用下式表示：SCO=TT-2NPD。最后，NCO的大小可依公式：NCO=1-(SCODCO)求得。当我们已估算出这一区域上NCO、SCO、DCO的值之后，可以由这些数值来推导出m值，平均交换次数m=SCO+2DCO=(TT-2NPD)+2(4NPD) =TT+6NPD将m转换为图距单位 图距 =50（TT+6NPD ）二三个连锁基因的作图(自学)1. 分类：确定由不交换、单交换、双交换产生的类型与频率；2. 确定基因顺序：根据三点测验中双交换类型频率确定基因顺序的原理，利用频率最小的包括两种亲本型孢子和两种重组型孢子的双线双交换类型确定基因在染色体中的顺序；3. 遗传距离估算：根据相邻基因间重组率计算遗传距离，绘制连锁图。三红色面包霉染色体的着丝粒作图1. 着丝粒作图 概念:以着丝粒作为一个座位，测定某一基因与着丝粒之间的距离，并进行基因在染色体上的位置作图。 原理：A 如果着丝粒与某一对杂合基因之间未发生交换，则该基因与着丝粒同步分离。此时，一对等位基因的分离为减数第一次分裂分离，即M1，形成非交换型子囊。B 如果基因与着丝粒之间发生了交换，则该基因与着丝粒的分离不同步。此时，一对等位基因的分离为减数第二次分裂分离，即M2，形成交换型子囊。C 当两对以上等位基因分离时，有序四分子分析不仅可以确定它们与着丝粒的遗传距离，还可以分析它们之间是否连锁。假设a与b两个位点，它们的关系仅有3种可能性：（1）a与b分别位于不同的染色体上（2）a与b位于同一染色体上着丝粒的两侧（3）a与b位于同一染色体着丝粒的同侧ab+杂交的子囊类型与数目孢子对子囊类型1-2aba+abab3-4aba+a+5-6+b+bab7-8+b+数目210512560分类PDNPDTTPDa分离MIMIMIMIIb分离MIMIMIIMII分析：（1）PDNPD，a与b连锁（2）若a与b在着丝粒两侧，则a MII分离、b MI与a MI分离、b MII分离两种情况均会发生，本例中无此情况，表明a和b在着丝粒的同侧。（3）由于a MII分离的同时，多数情况下b也发生了MII分离，可判断a位于着丝粒与b之间。（4）a与着丝粒之间的遗传距离=（1/2）（60/400）=7.5%=7.5 cMa与b间的遗传距离=50（125/400+65/400）=19.4 cM着丝粒与b间的遗传距离=7.5+19.4 =26.9 cM26.9b7.519.4a第二节 真核生物重组的分子机制重组(recombination)是已经存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组 (真核染色体减数分裂时独立分配和病毒基因组片段的重新分配); 而分子内或染色体内重组是酶依赖的过程，新的遗传物质通过DNA的剪切和连接产生。有五种类型的分子内重组，每种情况中分子反应DNA剪切、双链间的链交换、DNA修复和去除是相似的。重组和突变是遗传变异的两种截然不同的机制：重组是已经存在的信息重排，而突变是在基因组中导入新的信息。突变和重组在分子水平上是相互关联的。很多重组事件(特别是转座和不正常重组)会导致基因破坏，这称为突变。相反的，一些重组是修复潜在突变或致死DNA损伤所必需。重组的两种应用方式：对遗传座位作图和基因及基因组的操作。遗传作图根据染色体上两个基因座距离越远越容易发生同源重组的原理进行。因而一个特定杂交的重组产物的比例提供了对物理距离的估测。同源重组可被用于基因寻靶、而位点专一性重组可以诱导缺失和染色体重排。转座和不正常重组也被用来基因转移和整合。分子内重组的不同类型：1 同源重组(Homologous recombination) 重组对之间需要有同源性。调节这一过程的蛋白(如大肠杆菌中的RecA)不是序列专一性的，而是同源依赖的。经常涉及长的同源区域(如减数分裂中)。2 位点特异性重组(Site-specific recombination)重组对之间不需要同源性。调节这一过程的蛋白(位点特异性重组酶)在供体和受体分子中识别短的，特异DNA序列，这些蛋白之间的相互作用帮助重组。供体和受体位点之间经常存在同源性，因为同样的重组酶蛋白可结合两者的识别位点。3 转座重组（transposition recombination）重组对之间不需要同源性。调节这一过程的蛋白(转座酶，整合酶)识别重组分子中的短特异序列，这样的序列称为转座因子(识别位点经常是转座因子和宿主DNA之间的接合处)。受体位点一般在序列上相对非特异，重组将可转座因子整合到宿主DNA中(见第13章可移动的遗传因子)。4 不正常重组（illegitimate recombination）重组对之间不需要同源性或少量同源性，是异常细胞作用的结果。包括复制中不正常末端连接，链滑动或成环。不等交换(参阅)经常被描述成不正常，尽管其机制是正常的(但在错误的地方发生)同源重组。5. 拷贝选择(Copy choice)性重组：在RNA合成过程中，DNA模板改变，导致双亲重组RNA的形成。如RNA病毒。6 人工重组 体外用纯化的酶和底物进行的DNA连接引起的重组。一同源重组的发生1. 同源重组（交换）：两个染色体或DNA分子相互交换对等部分的过程。例：同源染色体非姐妹单体交换；细菌的转化、转导、结合；噬菌体的重组2. 条件：2个DNA分子序列同源（相同或相近），且同源区域越长越有利。3. 特点： 同源重组是双链DNA间的反应。 反应中涉及的酶可以用任何一对同源序列作为底物。 存在重组热点。 基因组中重组频率受染色体结构影响。如在异染色质附近，交换受到抑制。 两个DNA分子序列同源区越长越有利于重组。 4. 功能： A：维持种群的遗传多样性； B：有助于DNA的损伤修复； C：使真核生物产生第一次减数分裂中染色体正确分离到子细胞至关重要的瞬间物理连接。同源重组中负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱基序列的特异性。对于真核生物来说，染色质状态对重组也有影响，如异染色质及其附近区域很少发生重组。而大肠杆菌的同源重组需要RecA蛋白质的参与。二同源重组的分子模型1. Holliday模型1964年，Holliday R.设想了一个模式，用来解释同源重组，经过许多细节上的修改：（1）同源染色体的识别和配对排列（2）两条多核苷酸链在对应位置断裂并相互侵入（交换）（3）酶的作用使交换的链连接形成Holliday中间体（4）分枝移位（Branch migration）形成异源双链DNA（Heteroduplex DNA）（5）异源双链DNA转动，再次拉长Holliday中间体（6）由内切酶在水平方向或垂直方向切开Holliday中间体（7）产生带间隙的双螺旋（8）酶的作用使隙连接起来2. 双链断裂起始重组模型目前证明通过两个DNA分子之中的一个双链断裂引发重组是个常见的机制。该模型认为参与重组的两个DNA分子之一的两条链被核酸内切酶切断，然后在核酸外切酶作用下产生3单链黏性末端。两个3游离末端之一侵入到另一个双螺旋的同源区，置换供体双螺旋的一个单链而形成一段异源双链DNA，并同时产生一个D环（D-loop）。D环在DNA聚合酶的作用下修补而扩展，直至D环的长度与受体DNA双螺旋缺口长度相当，互补的两条单链退火。此时在缺口的两侧各有一段异源双链DNA，两个杂合双螺旋之间为断裂的缺口，并且此缺口为供体DNA序列所填充。缺口处双链的完整性可以被以缺口3端为起始的修补合成来修复。缺口是被两次单链DNA的合成而修复的。三有丝分裂分离与重组1 单倍体化与体细胞交换有丝分裂重组研究得较为深入的是真菌。我们将用曲霉属(Aspergillus nidulans)为例来说明。曲霉的有丝分裂分析是非常适合的。它的气生菌丝产生长链状的分生孢子（conidia），这是一种无性孢子。每一个分生孢子都有一个单个的核。任何一个孢子的表型都和它的基因型是一致的，这样便于鉴别。若将两个单倍体品系混合，菌丝融合，两种类型的核都同时存在胞质中，这种品系称为异核体（heterckaryon）。和其他品系一样，异核体将产生单核的分生孢子。在少数情况下异核体中的两个单倍体核融合产生一个二倍体核，这一过程称为二倍化（diploidization）。二倍体品系的曲霉产生的无性孢子将具有二倍体核。二倍体细胞是可能要经历有丝分裂交换，产生遗传重组。因为二倍体的核不稳定，最终通过有丝分裂产生单倍体核，此单倍体核含有来自两个单倍体亲本的等位基因的重组。由二倍体核形成单倍体核的过程称为单倍化（hapliodization）。在单倍化中，两个同源染色体自由化时，类似减数分裂，然后随机分离，各趋向一极。这种不同于减数分裂而导致基因重组的系统称为准性生殖系统（parasexual systems）。真菌的准性生殖周期由以下步骤组成：（1）在多核菌丝中形成异核体，（2）在异核体中不同基因型的单倍体核偶尔融合，（3）和单倍体核并排的二倍体融合核中进行有丝分裂交换，（4）二倍体融合核不经过减数分裂而完成单倍化。2 有丝分裂交换与基因定位如果某一个二倍体细胞的某一染色体臂上有若干个基因都呈杂合状态，那么就可根据子代体细胞各个基因纯合化的频率推知它们的相对位置。交换只使比交换位置更远离着丝粒的隐性基因纯合化，所以某个基因纯合化的频率愈高,它离着丝粒的距离就愈远（由杂合二倍体菌株的体细胞重组判断基因排列顺序的原理）。由于体细胞交换频率远远低于减数分裂过程中的交换频率，所以这一方法一般只用于不进行的生物如某些等的基因定位。这一方法也曾在衣藻中用来进行基因的定位。根据所测基因在某一已知染色体区段中是否存在的基因定位。如果染色体的某一区段的位置是已知的，而且测得某一基因的位置在这一区段中，那么这一基因的位置也就被测定了。现假设观察到对a、b、c、d、e中任何一个基因是纯合子的个体300个，分布如下：当a是纯合子的时候，b也是纯合子，但在有些克隆中，当b是纯合子的时候，a却不是，这说明a比b更靠近着丝粒。分析所有的克隆表型就会发现a是最近的，b次之，再着是c、d，最远的是e。某个体细胞克隆所出现的频率反映了某个有丝分裂交换所发生的频率，这个频率就可以用来计算有丝分裂图距(mitotic map distance)。根据上面的例子，在a和b之间发生交换产生bcde的纯合子表型，因此a和b之间的重组值为6030020%，即ab之间的图距为20。依此类推，a、b、c、d、e及着丝粒间的有丝分裂染色体图为：进行有丝分裂重组分析时需要构建杂合子。这可从构巢曲霉的两个不同品系开始构成异核体，然后再筛选出二倍体核。如两个单倍体品系为：品系1： w ad+ pro pab y+bio品系2： w+ ad pro+ pab+ y bio+这两个品系在基本培养基上都不能生长，但异核体由于基因的互补是可以生长的。w和y两对等位基因都是控制无性孢子的颜色的，w导致产生白色孢子，y导致产生黄色孢子。基因型为w+y+的品系是绿色的，wy+品系为白色，w+y品系为黄色，wy品系由于上位效应也是白色的(表4-4)。因此品系1是白色的，品系2是黄色的。在异核体中通常有黄色和白色的孢子混合。 表用于曲霉实验中单倍体和二倍体的基因型与孢子颜色的关系二倍体曲霉细胞繁殖所产生的菌落通常是绿色的(背景绿色，w+ w/y+ y)，但也会很少的产生白色和黄色的单倍体及二倍体区域。单倍体和二倍体区域可通过检查孢子的大小来鉴定，因为二倍体孢子较单倍体孢子大。所有这些单倍体区域的产生都是由于单倍体化的结果。我们先来考虑单倍体白色区，通过鉴定后发现白色区中有一半的基因型是w ad+ pro pab y+，一半的基因型是w ad pro+ pab+ y bio+。后面5个基因分成两组且都是亲本的性状，它们是按1:1分离的，说明这5个基因是相互连锁的，同样也说明w基因与这5个基因是位于不同的染色体上的，即w基因与5个连锁基因是自由组合的。通过以上白色区域的分析，我们可以将这6个基因分成二组，但对于5个连锁基因的作图是没有任何帮助的。为了对这5个连锁基因进行作图，我们必须研究第二种类型的分离子-二倍体分离子(diploid segregants)。我们在前面已经讨论过，有丝分裂交换使得交换点远端的所有基因纯合化。假设我们检出二倍体黄色分生孢子(y/y，二倍体孢子较大)，然后再分析其它基因的表型以确定分离子的基因型。在y/y的隐性纯合子中，有5.5%为pab和pro的纯合子，72%是pab纯合子，22.5%为原养型(即pab+ pro+ ad+)。由于在y/y分离子中没有一个是需要腺苷酸的，因而可推断ad位于染色体的另一臂上，因为发生在一个臂上的有丝分裂交换对另一臂上等位基因的分离是无效的，而在两臂同时发生有丝分裂交换是极其罕见的。通过有丝分裂定位得到的构巢曲霉的第一染色体图为： 染色体上面是有丝分裂定位数据，下面是减数分裂定位数据，两者定位数据相差甚远，但二者在顺序上是一致的。第三节 基因转变及其分子机制1. 异常分离与基因转换Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊孢子灰色，g+决定子囊孢子的黑色，在g+g-的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是53分离，0.05%是62分离，0.008是3113（或异常44）分离。(1)一个孢子中的两个孢子有着不同的基因型。(2)分离比例不是44。(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。1930年，德国遗传学家H温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。好象是由于一个基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换（gene conversion）。以后由于发现一个基因发生基因转变时，它两旁的基因常同时发生重组：在53和62分离的子囊中，大约有30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。 所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。 2. 基因转变及其分子机制 基因转变的类型：染色单体转变： 减数分裂的一个产物(一条染色单体)的两条链均发生了基因转变。6：2或2：6。半染色单体转变：基因转变只影响半个染色单体，即一条DNA链。5：3或3：5或3：1：1：3。基因转变的分子机制实质是遗传重组过程中留下的局部异源双链区，DNA错配碱基在细胞内的修复系统识别下所发生的一个基因转变为它的等位基因的现象。 *不同的切除会产生不同的结果。基因转变的解释 两个杂种分子均未校正,复制后出现异常的4+:4g(或3:1:1:3)的分离。两个杂种分子都被校正为+（或g)时，修复后出现6：2（或2：6）的的异常分离。只有一个杂种分子校正为+或g时，修复后出现5：3（或3：5）的分离。 当两个杂种分子都按原来的两个亲本的遗传结构进行修复时，则减数分裂的四个产物恢复成正常的配对状态，子囊孢子呈现正常的4：4分离。在62（或26）子囊，减数分裂的4个产物中，有一个产物发生基因转换，所以是染色单体的转换。 两种校正方式：不配对的碱基对由核酸外切酶切除，新合成的互补短链在连接酶的作用下连接上去。由于切除的不配对区段的不同，校正后或出现野生型或出现突变型。 在3113的子囊中，减数分裂的4个产物中，两个产物的一半出现基因转换，所以是半染色单体转换，分离一定发生在减数分裂后的有丝分裂中，所以叫做减数后分离。 在53的子囊中，减数分裂的4个产物中，有一个产物的一半出现基因转换，所以是半染色单体转换，分离一定发生在减数分裂后的有丝分裂中，所以叫做减数后分离。 第四节 真核生物遗传标记的特点及应用用于遗传作图的常用标记 标记定义和应用形态学表型形态学表型变异(包括疾病等)。用于符合孟德尔遗传的形态学变异的作图。受显性关系复杂性、非等位基因相互作用和环境效应的影响，人类疾病基因一般是二态表型变异蛋白多态性在电泳和等电聚焦时蛋白迁移率的差异。共显性和中等的多态性在数量上有限。很多蛋白的多态性不能通过电泳检测，因为有些氨基酸替代不改变蛋白的物理化学性质。同时，基因编码的多态性蛋白本身可能不被作图。限制性片段长度多态性(RFLPs)等位DNA片段中限制性位点的差异。是共显性和丰富的，但经常是二态性。如果变异位于限制性位点之外，很多顺序多态性就不能被检测。VNTRs，STR由于不同个体串联重复序列的数目和位置不同所引起的片段长度差异。因为其共显性和高度多态性是非常有用的标记。小卫星DNA组成的染色体座位具有丰富的多态性，即VNTR序列。微卫星DNA(STR)在整个基因组中平均分布，可以用PCR快速测定基因型。随机扩增的多态性DNA(RAPDs)以随机引物扩增的DNA片段。丰富，但并非总可以区分纯合和杂合基因型，有时重复性较差。仅限于植物基因组作图。单核苷酸多态性(SNPs)基因组内某一特定核苷酸位置上的核苷酸差异。在人基因组中平均每1300个核苷酸中有一个差别，数目多，覆盖密度大。重点介绍分子标记。1、RFLP标记限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 作为遗传标记是D Botstein等人于1980年提出来的，是第一代DNA标记。RFLP是指用限制性内切酶切割不同个体的DNA时，会产生长度不同的DNA片段，因为酶切位点的变化使得酶切后的DNA片段长度发生了改变，从而某位点上的DNA片段在电泳后用克隆探针检测时就会出现泳动行为上的改变。通过酶切位点产生的不同长度的片段，可以用来鉴定和区分不同的个体。对RFLP的检测最初是用Southen杂交的方法进行的。其基本过程是：取得DNA分子样本后，用特定的酶剪切，然后通过电泳将这些片段按长度分开，再将胶上的片段转移到硝酸纤维素膜上，最后用放射性标记的专一DNA探针杂交，探针将会杂交到相应的片段上，通过放射自显影就可以看到该片段并判断其位置和分子长度。如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可用PCR快速而简易地进行RFLP分析。首先用在多态性位点两侧的引物对不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后用相应的限制性内切酶消化，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小即可判断其多态性。RFLP作为人类基因组的一种遗传标记，其中许多已经定位。在此基础上，只要证明某一基因与某一限制性片段多态性连锁紧密，则两者必定在同一染色体上相邻的位置。有时作为病因的cDNA虽已分离，但其变异性质不明，或致病基因本身不明时，通过家系分析知道某一RFLP跟致病基因连锁，同样可以利用这一RFLP对该致病基因的遗传进行分析。但RFLP有明显的局限性。首先它是基于一个或少数几个核苷酸的改变所造成的限制性酶切点的能与不能切两种状态，因而所产生的不同长度的酶切片段（即所谓的等位片段），一般也只有2-3个，能提供的“多态性”信息有限；其次，有的核苷酸的改变是不能用限制性内切酶检出的；其三是检测某个座位的RFLP需要该座位的DNA片段作为探针，进行定点分析，并且需要放射性同位素标记与Southern杂交技术，因此存在着工作环境和费用等问题。2、微卫星标记、小卫星标记 1985年英国Leicester大学的A. Jeffreys与其同事在人的肌球蛋白基因中发现了一些短的简单重复单位，他称之为小卫星中心(minisatellite core)。随后的许多研究逐渐证明，在人类基因组中分布有大量的此类长度的多态性标记，在某一点上，可能只有一个重复单位，但更多的情况是成簇的，即以正向(头-尾)或反向(头-头或尾-尾)串联重复，并分布于基因组的各个部位。在某一位点上，数量可变的串联重复(variable number of tandem repeats，VNTR) (重复单位为6-12个核苷酸)可提供不同长度的片段。一例VNTR多态性，探针1是位于此特殊VNTR多态性旁的在基因组中独有的DNA片段，因此利用DNA印迹只能检测此一位点。对于所检测的三个个体在这个基因座都呈现杂合性(AB、CD、EF)，探针1是目前较常用的一类探针，因为任何两个非亲缘个体携带相同的两个等位基因的机率非常低，除非他们是单卵双生子；除探针1检出独有的VNTR外，探针2是根据VNTR多态性本身的串联重复序列设计的，因为同样的串联重复序列散布于基因组中(即VNTR多态性)，因此探针2在DNA印迹中将从这些众多多态性中检测到许多带谱，利用探针2这样的探针检测到的复杂谱带同时显示出许多多态基因座，因此在两个个体中很少一样，这就是我们前面所说的DNA指纹。1989年另一类称作微卫星标记(microsatellite marker)系统被发现和建立，它们的重复单位长度为2-6个核苷酸，它们被称作“微卫星或短串联重复(STR)”，是指DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，广泛存在于真核基因组中，多数以26个碱基为核心单位、串联重复排列的序列。STR有三个最突出的优点：一是高度多态性，由于(CA)n等简短重复不受进化上的选择，因而在同一位点中数目变化很大，在人群中因重复次数不同而产生等位片段，可形成多达几十种的等位片段（多态性）；二是作为遗传标记的高频率性，这样的位点在基因组中出现的频率很高，并且分布很广；第三是由于重复序列两侧的特异性单拷贝序列可作为其在基因组中定“点”的标记，可采用PCR技术使操作实现自动化。由于它在基因组中分布较广，数目多，且符合孟德尔遗传规律，因而可以为连锁分析提供足够多的遗传信息，加之可利用相对容易的PCR及电泳等手段进行检测，使得这一系统成为目前在基因定位的研究中应用最多的标记系统。事实上，在人类和哺乳动物的DNA分子连锁图谱中，微卫星已成为取代RFLP的第二代分子标记而被广泛使用。随着各种PCR技术的提高和相应电泳检测手段的进步，如自动测序仪应用于电泳产物检测，目前已经发展到大批量(如利用96孔板及配套的机械手进行PCR操作)、微量(总体积可降低到5ml)、多重PCR(Mutiplex PCR，在一个反应体系中同时进行多个DNA标记的扩增)和半自动乃至自动化的程度。VNTR和STR的遗传学图距与常规的遗传学图距一样，是以形成精子或卵子的减数分裂过程中，两个位点之间进行交换、重组百分率的结果以cM为单位的。3、SNP标记1996年，美国E. S. Lander又提出了称之为“第三代DNA遗传标记”的单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)，它是目前最有发展前途的一类新型DNA标记。SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同是不再以“长度”的差异作为检测手段，而直接以序列的变异作为标记。我们知道，在一个群体中基因组内某一基因座上可以有两个或两个以上的等位基因，这是等位基因的多态性。同样，在基因组内某一特定核苷酸位置上，也可以有不同的核苷酸。基因组中单核苷酸的置换使得群体中基因组的某些位点上存在差别，如同等位基因那样可以有两种或两种以上的不同核苷酸。SNP就是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1%（低于1%则视为点突变）。基因组DNA双链的某个核苷酸位点上，当一条链上的核苷酸发生置换时，其互补链的对应位点上同样也发生核苷酸置换，此时只计为出现一个单核苷酸多态。基因组中单核苷酸的缺失、插入与重复则不属于SNP。值得注意的是，虽然SNP既能在编码基因也能在非编码基因中发生，但基因组内不同位点的杂合性存在差异，如基因的编码序列由于选择压力，杂合的可能性要小一些（在编码基因中出现的叫cSNP），而在HLA的某些非编码区内，杂合性可达5-10。就整个基因组而言，两个不同个体之间约有几百万个碱基