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临床免疫检验的质量保证 2 免疫检验自动化仪器复习考查题 1 化学发光免疫分析仪的检测原理2 酶联发光免疫分析仪的检测原理3 电化学发光免疫分析仪的检测原理 3 答案 1 直接化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原 以磁性微粒为固相载体的一种自动化免疫分析仪器 直接 吖啶酯标记 发光只需加入氧化剂和pH纠正液 不需要酶催化 2 酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体 在抗原抗体反应后 加入底物 发光剂 由酶催化和分解底物发光 通过光信号的强弱来进行定量 常用的标记酶有辣根过氧化物酶 HRP 和碱性磷酸酶 ALP 常用的发光底物有鲁米诺 AMPPD和4 MUP等 3 电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术 生物素放大技术 以磁性微粒为固相载体 用三联吡啶钌标记抗原或抗体 三丙胺 TPA 为电子供体 而设计的一种自动化分析仪 4 内容第一节分析前质量控制第二节分析中质量控制第三节分析前质量控制 5 概述 质量保证是临床实验室为证明提供给患者临床诊疗或临床实验研究数据的有效性而采取的一系列措施 涵盖了实验室内进行检测前后的所有活动 临床免疫学检验既有手工操作 定性或半定量的试验 也有以各种新技术 新方法为基础的自动化仪器定量试验 由于它们流程复杂 影响结果的因素很多 包括从样本采集前患者准备到检验报告的审核 发送以及与临床进行沟通等流程的各个方面 通常 将这个完整的检验流程分为分析前 分析中 分析后三个过程 对这三个过程实行质量控制的侧重点各不相同 6 第一节分析前质量控制 分析前是指从临床医生开出医嘱起 按时间顺序的步骤 包括提出检验要求 患者准备 原始标本采集 运送到实验室并在实验室内传送 至分析检验程序启动前的过程 分析前质量管理是决定检验结果正确 可靠的前提 涉及包括检验人员 临床医师 护士 护工以及受检者本人等各部门 任何环节的疏漏或不规范均可导致检验结果的误差 一 检验项目的申请检验申请是检验流程的重要环节 其信息规范性与完整性对后续检验流程十分重要 申请有纸质和电子形式或两者同时使用等方式 7 一 申请单格式和填写按照国家相关规定 检验申请单基本信息应至少包括 受检者唯一性标识 如姓名 性别 年龄 科别 病房 门诊号 住院号等 临床诊断或疑似诊断 标本类型 检验项目 送检日期 年 月 日 及标本采集时间与标本接受时间 申请者唯一标识 医师签字 收费 记账以及检验号等 检验申请单的填写内容要规范 完整 以保证为后续检验流程提供必需的信息 二 检验项目的申请原则临床医生可根据就诊者的疾病诊疗需要而选择合适的检验项目 检验人员也应根据检验项目的检测性能 与临床医生定期沟通 以保证检验项目的有效性 及时性 经济性 8 二 患者准备医护人员 样本采集人员 检验技术人员应了解采集前患者的状态要求和影响结果的非疾病性因素 并将相关的要求和注意事项通过合适的途径告知患者 以获得患者的配合 保证所采集标本能客观真实反映当前的疾病状态 三 标本的采集 传送与保存 一 标本的采集对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集 要注意收集时间及体位对测定结果产生的影响 如可的松在早晨4 00 6 00之间 会有一峰值出现 生长激素 促黄体激素 LH 和促卵泡激素 FSH 均以阵发性方式释放 当从卧位变为站立位时 血清中肾素活性将出现明显增高 治疗药物的监测 应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测 9 用于传染性病原体的抗原和抗体 肿瘤标志物和特种蛋白等检测的血清标本的收集则无时间和体位等的影响 采样量应根据检测的需要而定 首先必须满足检测需要 但不过分采集 标本应采集在密闭的容器中 以方便后续的传送 每个标本应有唯一性的标志 保证标本与检验申请单相对应 很多临床免疫检测项目不能当天完成 实验室经常通过 分单 的方式将标本和尚未完成的检测项目从现有申请单中分出 在这种情况下 一定要保证分单标本有唯一性的标志 并保证能溯源到原始标本 10 二 标本的传送及保存标本自采集后到送达检验部门的过程即标本的传送 标本传送过程中应保证标本的密闭 防震 防漏 防污染 运送过程尽可能快捷 特殊标本如胰岛素 C肽等测定时 应尽量置冰盒中送检 随着辅助技术的发展 为保证标本传送的可靠 及时 有些实验室选择安装了气动 真空 或履带式标本智能化传送系统 可方便地实现标本在病区 门诊 急诊和实验室间的传送 11 四 影响分析前质量的因素 由于免疫检测的被测量对象通常在体内的含量很低 因此 影响这些对象检测结果的因素也很多 此外 由于分析前质量管理的特点 如很多因素是实验室不可控制的 需要临床医生护士的参与和配合 有些质量缺陷不能被及时发现 即便发现问题 有些责任也无法落实到人 因此 建立完整的分析前质量管理体系是确保分析前质量的有力保证 12 第二节分析中的质量控制 分析中阶段是指从标本前处理到标本检测完成 形成报告结果的过程 包括标本前处理 标本的检测 还包括检测体系的建立 人员培训 检测系统的选择和性能确认 室内质量控制和室间质量控制 实验室间比对等内容 是决定检验结果正确 可靠的关键 也是临床免疫检测质量保证的核心 13 一 工作人员培训 临床免疫检验的项目广泛 检测技术众多 既包括手工操作 又包括自动化仪器操作 要求工作人员具有一定的技术知识和经验 特别是采用手工操作的检测项目 不同的工作人员的操作及结果判断的主观性往往导致检测结果的差异 因此 为了使工作人员具备进行临床免疫检验的相关技能 根据实际工作的需要 建立定期培训计划 保证工作人员的技能满足临床免疫检验的需要 14 二 检测系统性能的确认 检测系统定义 是指完成一个检验项目的测定所涉及的仪器 试剂 校准品 耗材等的组合 15 临床免疫检验中使用的检测系统的好坏 将直接影响检测结果的质量 在将确定的检测系统应用到临床前 需要通过评估来判断该检测系统的性能是否符合厂家申明 是否符合临床要求 临床免疫检测系统性能的评估内容至少包括精密度 批内 批间 准确度 分析测量范围 临床可报告范围 参考区间验证等内容 必要时 针对某些特殊项目 如促甲状腺激素 TSH 肌钙蛋白I Tnl 等 还需要确定检测系统的分析灵敏度 16 三 标准操作规程 standardoperationprocedure SOP 的建立 在免疫测定中 试剂准备 加样 温育 洗板 显色 或测定信号激发 和测定等每一步骤均可能对测定结果产生较大影响 确保检测结果可靠性首先考虑的是改善测定精密度 因此必须着重在最不精密的步骤上 为此 需要将每个操作步骤标准化并形成SOP 所有的实验技术人员在进行相关测定时 必须严格按相应的SOP进行操作 根据卫生部行业标准 SOP内容应包括实验原理或检验目的 标本种类及收集要求 操作步骤 试剂准备 加样 孵育时间 孵育方式 显色时间等 计算方法 参考范围 临床意义 操作注意事项 参考资料等内容 对于仪器的标准化操作程序也有相应的要求 17 四 标准曲线的校准与标准品值的溯源 一 标准曲线的校准所谓标准曲线的校准 是指将标定了分析物浓度的定标品在检测系统上检测并获得分析物浓度高低与检测设备信号强弱之间关系的步骤 进行校准的目的是为了实现待检物质的定量检测 因此 校准是针对定量检测设备而言的 定性和半定量检测不存在校准的概念 在下列情况时 需要对标准曲线进行校正 标准曲线过期 在新批号试剂使用前 仪器相关部位经过较大维修 配件更换或缓冲液等试剂的升级 值得一提的是 室内质量控制结果超出范围时 并不需要在第一时间进行校准 只有在排除其他可能 并确认可能是由于标准曲线漂移而导致的失控的情况下才需要重新校准 18 二 标准品值的溯源 标准品的特性应该清楚明确 理想的标准品应该是纯品 但如特定分析物质具有同种型不均一性 则相应的标准品也应具备这种特点 这种要求通常难以满足 因为在纯化过程中 使用生化方法去除杂质会引起特定物质同种型的少量丢失 而使用免疫亲和层析纯化 则由于洗涤过程常需在低pH变性条件下进行 有可能会引起某些蛋白的不可逆修饰 基因重组蛋白 一是表达产物仍需纯化和糖基化 二是糖基化可能与天然蛋白有所不同 目前 真正具有国际参考物质的免疫测定项目并不多 国家临床实验室标准化委员会 NationalCommitteeofClinicalLaboratoryStandardisation NCCLS 以及美国和加拿大临床化学协会 AmericanSocietiesforClinicalChemistryandCanadianSocietiesforClinicalChemistryandCanadian AACC和CSCC 等正致力于免疫测定的标准化工作 这些组织也制备一些标准品 19 理想的标准品应具备的特征 1 标准品的基质通常为含蛋白的缓冲溶液 对测定结果无明显影响 2 对标准品的浓度一般无特殊要求 在方法的测定范围内即可 3 保持稳定性 在一定时间内 在规定的保存条件下应有良好的稳定性 4 无己知的传染危险性 对已知的经血液传播的病原体如HIV HCV和HBV等必须作灭活处理 5 靶值或预期结果已定 20 21 22 应选用制造商提供了溯源性的产品 为保证临床免疫检测结果的可比性 针对已建立国际标准的检测项目 应要求所选用检测系统的制造商提供溯源性文件 即证明通过该检测系统的检测结果 通过校准品可逐级溯源到国际参考物质 internationalreferencematerial 通常国际参考物质为一级标准品 国家标准品则为二级标准 可溯源至一级标准 二级标准可用来维持校准 三级标准品则通过与二级标准的比对而来 为通常使用的商品校准品 从一级标准的值传递到最终试验所使用的校准物的过程通常由几个校准步骤组成 包括标准品和测定方法 缓冲液及其基质 稀释的控制 最终结果的统计学评价和质量控制等 不同的分析物如血清蛋白 多肽激素或与载体蛋白结合的低分子量激素等其校准过程有所不同 标准品值的溯源模式图见图19 1 23 校准品值溯源模式图 24 室内质量控制 InternalQualityControl IQC 由实验室人员采取一定的方法和步骤 连续评价本实验室工作的可靠性程度 旨在监测和控制本室常规工作的精密度 提高本室常规工作中批内 批间样本检验的一致性 并确定当批的测定结果是否可靠 可否发出检验报告 免疫定量测定IQC的方法 包括 一 二 三 四 五 六 内容略 五 定量免疫测定的室内质量控制 25 六 半定量及定性免疫测定的IQC 半定量及定性免疫检验方法较多 主要有沉淀试验 凝集试验 荧光免疫试验 化学发光免疫试验和酶免疫试验等 测定结果的判断为反应性或非反应性 阴性或阳性 此类测定的质量控制要点是测定下限 因此应选择靶抗原或抗体浓度接近试剂盒或方法的测定下限的质量控制品进行室内质量控制 并与临床标本的测定同时进行 以判断检测方法的有效性 如自身抗体检测的荧光免疫试验 每次测定都应至少带一个已知的弱阳性对照 从而有助于判断临床标本的检测结果是否有效 此外 根据所用方法的特点 如酶免疫试验中双抗夹心模式中的一步法 还须用高浓度质量控制品进行质量控制 以防止前带现象的发生 至于阴性质量控制 对于定性免疫检验来说 也是必需的 半定量及定性的免疫测定室内质量控制结果 由于结果判读 记录容易 一般不需要像定量免疫测定项目一样使用质量控制图进行判断 26 七 室间质量评价 ExternalQualityAssessment EQA 为客观地比较某一实验室的测定结果与靶值的差异 由外单位机构 采取一定的方法 连续 客观地评价实验室的结果 发现误差并校正结果 使各实验室之间的结果具有可比性 是对实验室操作和实验方法的回顾性评价 能力比对 proficiencytesting PT 将多个样品定期送往实验室组的成员进行分析和 或鉴定 将每一实验室的结果与同组内其他实验室的结果或目标值比较 并将比较结果报告给参与的实验室 室间质量评价内容 包括 一 二 三 略 27 八 实验室间比对和人员比对 实验室间比对是按照预先规定的条件 由两个或多个实验室对相同或类似检测物品 通常是新鲜患者标本 进行检测 相对于室间质量评价 实验室间比对可弥补实验室因室间质量评价项目涵盖因素 或因成本问题不能参加的缺陷 也可消除或减少室间质量控制品的基质效应 还可评估实验室分析前的误差 特别适用于室间质量评价不包括的项目 通常用于与上级或同级医院实验室间的比对 以评估该检测项目结果的可靠性 判断依据同室间质量评价结果的评价依据 28 人员比对是指实验室为发现及纠正不同工作人员从事相同检测项目而导致结果存在不可接受的偏倚而采取的措施 由于不同的实验室人员可能从事同一项目的检测 特别是对于手工检测项目 实验室必须定期对人员间进行比对 以评估该检测项目结果的可靠性 判断依据同室间质量评价结果的评价依据 29 九 实验室环境 设施及设备的控制 处于良好运行状态的临床实验室 应有充分的空间 良好的照明和空调设备 实验室仪器设备应保养良好 临床免疫检测项目检测过程中涉及的关键设备 包括但不限于离心机 加样器 温度计 孵育箱 酶标读数仪 各种全自动检测设备等 均应由有资质的单位或授权者进行定期校准 以保证使用中的有效性 30 第三节分析后质量控制 分析后的质量控制是指对获得检验结果后的主要过程进行质量控制 主要包括检验结果的审核和发放 检验后标本的保存与处理及为患者和医护提供咨询服务等 一 检验结果的审核和发放检验结果的审核是分析后质量控制中的关键环节 只有审核合格后的检验报告才能发送给临床 检验报告的报告方式应符合规定 并被临床接受 检测项目名称及结果描述的应规范 31 一 报告审核和发放制度实验室应当制定报告审核和发放制度 报告审核者由具有中级职称以上的工作人员承担 审核的内容应包括 检验申请的检测项目完成是否完整 检验结果的格式是否正确 报告单内容是否正确 检验过程中的室内质量控制是否在控等 有经验的复核工作人员还应根据患者提供的临床诊断等信息 评估检测结果与患者病情的符合性 如遇到怀疑或明显不符合的情况 应对本次检测结果进行认真复核 避免可能存在的问题 可通过及时与临床医护 患者的沟通来获得更多的信息 这就要求审核人员具有一定的临床基础知识 审核完成的检验报告应按与临床约定的时间和有效的方式送达临床 危急值的发送应根据相关法规 规定及时报告 32 二 自动审核系统随着实验室信息系统 laboratoryinformationsystem 功能的不断发展 有条件的实验室可根据实际情况发展报告自动审核系统 resultsauto verificationsystem 通过设定一定的规则 如与历史结果的比对 与参考范围比对等方式实现部分检测结果的自动发送 降低审核者的劳动强度 保证审核者将精力放在真正需要复核的报告中 需要注意的是 设置的自动审核规则在应用前 应使用既往数据进行审核 要求与人工审核的符合率为95 以上 33 二 检验后标本的保存与处理 一 检验后标本的保存检验后标本保存的目的是为了必要的复查 对于临床免疫学检验后的标本保存时间和保存方法 室温 4 冰箱 200C低温冷藏等 应根据工作需要 相关法规的规定 如HIV抗体检测后标本 及分析物的稳定性而定 检验后标本的保存必须尽可能的保证分析物的稳定性 以保证复检中获得的结果与新鲜标本的结果一致 因此 在选择保存条件时 实验室应对各种保存条件对主要分析物稳定性的影响进行确认 必要时应分离血清 血浆 细胞成分等进行分别保存 34 二 检验后标本的检索各实验室保存的条件不尽相同 有些保存在冰箱中 有些保存在冷藏库中 对于标本量特别大的实验室 检索一个保存标本往往需要很长时间 为便于保存标本在需要时方便的获得 通常要求按照标本的唯一标志作为检索条件 目前 有些实验室已借助于实验室自动化系统或自动样本前处理系统对所有检测后标本进行重新排列 并由信息系统自动记录标本和保存位置的对应关系 需要时即可查询获得相关信息 三 检验后标本的处理检验后标本的处理应根据有关法律法规对二级生物实验室的要求 按照潜在生物危害的物品处理方式进行处理 35 三 咨询 一 咨询服务的提供实验室应主动为患者和临床医护提供检验结果的解释和咨询服务 以使检验结果在诊断 治疗中发挥更大的作用 为临床提供咨询服务的工作人员不仅限于检验医师 也包括具有丰富工作经验的技术人员 在提供咨询服务时 实验室工作人员应对由于检测系统 疾病的自然发展过程 标本的质量等因素造成检测结果的影响做出解释 并对由于参考范围 临界值 医学决定水平不同而对检测结果的影响做出解释 由于免疫测定对象相对比较微量 且可随生理活动而出现较大范围的变动 因此向临床提供咨询服务的优劣将直接影响到临床医护人员对免疫测定结果的认同 36 二 与临床的沟通实验室应建立与临床定期沟通的机制 了解临床对于实验室的需求 投诉及意见反馈等 并对工作方式和流程及提供服务的质量进行评估 通过持续性改进措施 提高检测和服务质量 通过与临床的沟通 实验室还可推广检验新项目和新方法 并向临床说明实验室免疫检测项目检测结果的不确定性及检测方法的局限性 因此 加强临床沟通 是做好实验室工作 更好地为临床服务的基础 也是实施全面质量管理的目的 37 本章小结 临床免疫检验的质量保证是临床实验室为证明提供给患者临床诊疗或临床实验研究的数据的有效性而采取的一系列的措施 免疫检验的步骤很多 根据样本流程 可分为分析前 分析中 分析后流程 各流程实行质量保证的内容不同 38 分析前质量管理由于分析前质量管理的特点 很多因素是实验室不可控制的 需要临床医护的参与和配合 因此 建立完整的分析前质量管理体系是确保分析前质量的有力保证 39 分析中质量控制是实现质量保证的重要内容 而室内质量控制和室间质量评估是重中之重 IQC的概念已覆盖了测定分析前的仪器设备状态 试剂方法的选择 SOP的制定及人员培训和测定分析后评价等各个与质量有关的方面 采用统计学方法评价临床免疫检验的结果 是临床免疫检验IQC的中心环节 其伴随着每一次常规检测的始终 决定了当批测定的有效性 应根据自身实验室的特点选用适当的统计质量控制方法 EQA作为IQC的补充 在临床免疫检验的质量保证中是一个不可或缺的部分 但免疫检验在临床指标测定中的应用极为广泛 有很多缺乏参考方法 难以校准 再加上检测技术多种多样 不同方法和试剂间的偏差仍然是不同实验室测定结果间缺乏一致的直接原因 因此 EQA的实施 将有力地促进临床免疫检验的标准化 对于一些特殊的临床免疫检测 实验室还应定期进行实验室间比对和人员比对工作 40 分析后质量控制重点在于与临床医护建立定期的沟通机制 能影响临床免疫检测的很多因素常常不在实验室的直接控制下 但实验室有责任为患者或临床医生如何正确地使用实验室测定结果提供明确的建议 并在适当的情况下 对测定结果做出解释 41 临床免疫检验实验室的质量保证是实验室的核心内容 要做好质量保证 必须要了解影响实验室测定质量的实验室过程的所有步骤 实验室测定过程中最薄弱的环节将直接影响整个实验室的检验质量 实验室只有建立完整的质量保证体系 并严格实行 才能从根本上保证临床免疫检测的质量符合临床的需要 现代的免疫检验实验室已经进入到信息时代 建立实验室质量管理的信息系统 将使实验室硬件和软件的管理变得简单易行 并更容易与临床建立起有机的联系 从而树立实验室质量管理的新理念 42 完 43 临床免疫检验质量保证章节考查题 1 临床免疫检验质量保证的主要内容包括哪几个 2 你认为临床免疫检验质量保证的主要内容中主要与临床医生 护士或患者有关的是什么环节 主要与检验人员相关的又是什么环节 3 在与检验人员主要相关的环节中你认为最重要的是那几点 44 45 第七节影响免疫实验结果的标本因素 46 标本类型及采集容器要求标本采集时间及患者准备要求内源性干扰因素外源性干扰因素 一 标本的正确收集及处理 47 最常用的标本类型 血液 血清 血浆和全血 唾液或尿液 采集容器最好为一次性无菌密闭容器 建议采用真空采血管及蝶形针具 以免直接接触血液 标本类型及采集容器要求 48 二 标本采集时间及患者准备影响因素 激素和治疗药物感染性病原体抗原 抗体肿瘤标志物特定蛋白后三者是主要的内源性干扰 犹应重视 49 三 内源性干扰因素 有 类风湿因子 补体 异嗜性抗体 治疗性抗体 自身抗体 溶菌酶 冷凝集素 磷脂 药物小分子 总蛋白浓度等 影响 它们可引起免疫实验的假阳性或假阴性结果 Ig分子结构图 重链 轻链 50 稀释标本改变标记抗体用变性IgG预先封闭标本中RF测抗原 可先加入还原剂如2 巯基乙醇去除RF使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体 类风湿因子干扰的排除 51 补体干扰 固相抗体和标记抗体的分子可因环境 PH等因素改变而发生变构 使其Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来 这时如存在补体 它就成为一个中介物将固相抗体和标记抗体二者交联起来 从而出现假阳性结果 变构的固相抗体 标记抗体等也会因为活化补体的结合 封闭抗体的抗原表位结合能力 而引起假阴性结果或结果偏低 52 补体干扰的排除 56 30min加热可使标本中补体C1q灭活使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体 53 异嗜性抗体的干扰 天然的异嗜性抗体 IgG 可分为两类 可结合于小鼠 大鼠 马 牛和山羊IgG的Fab区域可结合于小鼠 马 牛和兔IgG的FC区表位 通过交联固相和标记的单抗或多抗而出现假阳性反应 54 异嗜性抗体干扰的排除 使用特异的兔F ab 2片段作为固相或标记抗体 在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig 封闭可能存在的异嗜性抗体 但加入量不足或亚类不同时无效 使用靶特异的非Ig亲和蛋白 Affibody 替代固相或标记抗体之一 采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球菌A蛋白 SPA 联合文库的人IgA结合亲和蛋白 用于IgA的测定 不受异嗜性抗体的影响 使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体 55 抗鼠Ig抗体的干扰 抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的免疫测定可产生假阳性结果 排除 使用特异的抗体F ab 2片段作为固相或标记抗体 在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig 封闭可能存在的抗鼠抗体 使用特异的鸡抗体IgG作为固相和标记抗体 因鸡IgG不与人抗鼠抗体反应 56 自身抗体干扰 自身抗体如抗甲状腺球蛋白 抗胰岛素等 能与其相应靶抗原结合形成复合物 在免疫测定方法中可干扰相应抗原抗体的测定 为避免以上情况出现 可在测定前用理化方法将其解离 57 溶菌酶干扰 溶菌酶有与等电点低的蛋白结合的特性 双抗体夹心法ELISA测定中 溶菌酶可在包被的IgG和标记的IgG 它们等电点为5 间形成桥接 从而导致假阳性 去除溶菌酶或将其封闭 Cu2 离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶 防止其联