2+核酸的化学2.ppt

第四章核酸的化学 1 最早1868年 瑞士科学家Miescher从绷带脓细胞中发现含磷2 5 的化合物 称为核素 2 1881年 Altmann从小牛胸腺 酵母中得到 它不含Pro 命名为核酸 3 1914年 把小牛胸腺中得到的核酸称胸腺核酸 动物核酸 把从酵母中分离得到的核酸称酵母核酸 植物核酸 4 1944年 Avery研究肺炎球菌转化实验 证明DNA是遗传物质的结论 核酸的发现及研究进展 最初是1928年 Gniffith以肺炎球菌作为转化的材料 肺炎球菌光滑型 S型 菌落光滑 有荚膜 有毒性 粗糙型 R型 菌落粗糙 无荚膜 无毒性 活体转化 四组实验 活S型菌 Rat die 活R型菌 Rat live 加热杀死的S型菌 Rat live 加热杀死的S型菌与活R型菌混合 Rat die说明R型菌可以转化为活S型菌 加热杀死的S型菌中有一种物质可使活R型菌转化为S型菌 1944年美国科学家Avery做了大量实验确定这种物质是DNA 转化因子 5 1953年 沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型结构 不但阐明了DNA结构 而且对DNA的复制 遗传物质的传递 都作了重要的说明 6 20世纪70年代 DNA重组技术应用 基因工程诞生 7 2000 2002年人类基因组计划完成 第一节核酸的概念和化学组成 一 核酸的概念和重要性 核酸是由核苷酸组成的具有复杂三维结构的大分子物质 包括DNA和RNA 脱氧核糖核酸 DNA 主要分布在细胞核DeoxyribonucleicAcid核酸核糖核酸 RNA mRNA rRNA tRNA分布在细胞质和细胞核中HnRNA SnRNA RibonucleicAcid 重要性 1 核酸是遗传变异的物质基础2 核酸与生物遗传信息的传递DNA则是遗传信息的载体 RNA主要参与遗传信息的表达3 核酸与医药 RNA 来源于微生物发酵 动物内脏 可用于改善精神迟缓 记忆衰退 刺激造血 促进白细胞再生 治疗初级癌症 DNA 来源于微生物发酵 可用于改善疲劳 提高抗癌疗效 免疫核糖核酸 iRNA 来源于免疫的动物内脏 用于肿瘤的免疫治疗 多聚核苷酸 polyC polyI 来源于微生物发酵和化学合成 作为干扰素的诱导剂 核苷 磷酸 IMP CMP UMP 来源于微生物发酵 IMP 治疗肝炎 肾炎 白血球升高等症CMP 治疗肝炎 肾炎 白血球 血小板升高 3 核酸与医药 二 核酸的基本结构单位 单核苷酸 核酸是以单核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链 核酸的结构层次 核酸 核苷酸核苷酸 磷酸 戊糖 含氮碱 核酸的化学组成 1 元素组成C H O N P 一 核苷与核苷酸 核苷酸 由碱基 戊糖和磷酸组成和化合物 是核酸的基本结构单位 核苷酸 含氮碱 戊糖 磷酸 1 碱基 嘌呤 purine 腺嘌呤 adenine A 鸟嘌呤 guanine G 嘧啶 pyrimidine 尿嘧啶 uracil U 胞嘧啶 cytosine C 胸腺嘧啶 thymine T DNA碱基 dA dG dC dTRNA碱基 A G C U 稀有碱基 P105 2 戊糖有核糖和脱氧核糖两种 RNA 核糖DNA 脱氧核糖 两类核酸的化学组成 3 核苷戊糖与碱基缩合而成的糖苷称为核苷 nucleoside 戊糖与碱基之间的连接键C N键 称为C N糖苷键 AdenosineGuanosineCytidineUridine AdenosineGuanosineCytidineUridine H H H H H 脱氧 脱氧 脱氧 脱氧 稀有核苷 是由 稀有碱基 所生成的核苷 假尿苷 4 核苷酸核苷中戊糖的羟基磷酸酯化 就形成核苷酸 nucleotide 核苷 磷酸 核苷酸核苷 脱氧核苷 和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸 脱氧核苷酸 根据核苷酸分子中戊糖的不同 核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类 ATP dATP 核苷酸的分子结构 自然界中存在的游离核苷酸多为5 核苷酸 5 核苷酸又可按其在5 位缩合的磷酸基的多少 分为一磷酸核苷 核苷酸 二磷酸核苷和三磷酸核苷 多磷酸核苷酸 二 环化核苷酸 cAMP cGMP 5 核苷酸的磷酸基可与戊糖上的3 OH缩合形成3 5 环核苷酸 它们在组织细胞中起着传递信息的作用 称为 第二信使 控制生物生长 分化等 三 辅酶类核苷酸 1 辅酶I NAD 和辅酶II NADP 尼克酰胺腺嘌呤尼克酰胺腺嘌呤D 核糖D 核糖D 核糖D 核糖磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADP 在糖 脂肪和蛋白质代谢中起着重要的作用 NAD和NADP 功能 是多种重要脱氢酶的辅酶 2 黄素腺嘌呤二核苷酸 FAD 核醇磷酸磷酸D 核糖核黄素异咯嗪腺嘌呤功能 在脱氢酶催化的氧化还原反应中 起着传递电子和质子的作用 3 辅酶A CoA CoA SH 腺嘌呤氨基乙硫醇D 核糖磷酸泛酸磷酸磷酸 功能 是传递酰基 是形成代谢中间产物的重要辅酶 第二节核酸的分子结构 一 DNA的分子结构包含一级结构 二级结构和三级结构 一 DNA的一级结构 核酸是由许多分子单核苷酸构成的 核酸的一级结构是指构成核酸的各个单核苷酸之间连接键的性质 以及组成中核苷酸的数目和排列顺序 碱基排列顺序 一分子的核苷酸的3 位羟基与另一分子核苷酸的5 位磷酸基通过脱水可形成3 5 磷酸二酯键 从而将两分子核苷酸连接起来 1 核酸的连接方式 核酸就是由许多核苷酸单位通过3 5 磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物 核酸具有方向性的长链状化合物 多核苷酸链的两端 一端称为5 端 另一端称为3 端 RNA由AMP GMP CMP和UMP组成 DNA由dAMP dGMP dCMP和dTMP组成 5 pdApdCpdGpdTOH3 5 pApCpGpUOH 3 或5 ACGT3 5 ACGU3 ACGTACGU 不同DNA的核苷酸数目和排列顺序不同 生物的遗传信息就储存记录在DNA的核苷酸序列中 2 多聚核苷酸的表示方式 3 DNA一级结构的不同是物种差异的根本原因 基因组的概念 一个物种的单倍体染色体中的全部DNA 称为该物种的基因组 genome 真核生物基因组的特点 重复序列 单拷贝序列 结构基因 大多数蛋白质的基因 人类基因组中单拷贝序列约占DNA总量的60 65 中度重复序列 几十到数万次 300 7000bp 与单拷贝序列间隔排列 rRNA tRNA 部分蛋白质基因 调控基因Alu家族和KnpI家族 高度重复序列 重复几百万次 10bp短序列 一般位于着丝粒和端粒 不转录 卫星DNA 结构基因中编码片段被非编码片段隔开 内含子 intron 外显子 exons 基因家族 许多来源相同 结构相似 功能关联的基因或串联排列集中成基因簇 rRNA基因 组蛋白基因等 或分散在不同部位 珠蛋白 生长激素等基因 原核生物基因组的特点 每个基因在基因组中仅出现一次或几次 而且主要为编码蛋白质的结构基因 其次为调控序列 功能关联的基因常集中在一起 在DNA分子的特定部位形成一个功能单位 操纵子 相关的结构基因常转录成一个mRNA 有重叠基因存在 同一段DNA可编码多种蛋白质分子 常见于病毒 线粒体 叶绿体和质粒DNA分子 三 DNA的二级结构 DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式 它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型 DNA双螺旋模型要点 1 DNA双螺旋分子由两条多核苷酸链组成 反向平行 即一条链走向3 5 另一条链为5 3 两条链均为右手螺旋 围绕同一中心轴形成右手螺旋 2 脱氧核苷酸和磷酸基形成的链为基本骨架 在螺旋外侧 碱基分布在螺旋内侧直 3 每个碱基对位于同一个平面内 碱基平面与中心轴垂直 相邻两个碱基距离为0 34nm 每螺旋一圈有10对碱基 相邻碱基平面距离为3 4nm 4 内侧互补的碱基通过氢键性形成 A T之间形成三个氢键 G C之间形成两个氢键 5 双螺旋结构上有二条螺形凹槽 一条较深 一条较浅 较深的沟称大沟 较浅的沟称小沟 DNA双螺旋的稳定因素 DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的 1 碱基平面之间堆积力是维持双螺旋结构的主要力量 2 碱基对之间的氢键 3 磷酸基团上的负电荷和介质中的阳离子形成的离子键 DNA双螺旋结构种类 DNA二级结构具有多态性 目前已知DNA双螺旋结构可分为A B C D及Z型等数种 除Z型为左手双螺旋外 其余均为右手双螺旋 1 B DNA螺旋 DNA在92 相对湿度的钠盐中的构型 是细胞正常状态下DNA存在的主要构型 2 A DNA螺旋 DNA在75 相对湿度的钠盐中的构型 3 C DNA螺旋 DNA在66 相对湿度的锂盐中的构型 4 Z DNA螺旋 左手的DNA螺旋 这种螺旋可能在基因表达或遗传重组中起作用 除双螺旋结构外 还有极少数的DNA分子是三螺旋结构的 四 DNA的三级结构 在DNA双螺旋二级结构的基础上 双螺旋的扭曲或再次螺旋就构成的DNA的三级结构 超螺旋是DNA三级结构的一种形式 超螺旋的形成与分子能量状态有关 1 原核生物DNA的三级结构 超螺旋DNA状态 松弛态超螺旋 叶绿体DNA 线粒体DNA 环状DNA状态的转变 2 真核生物染色体 真核生物具有三级结构的DNA和组蛋白紧密结合 以核小体作为基本单位组成染色质 许多核小体串联在一起 再经过反复折叠缠绕 压缩形成超螺旋结构 H1 核小体结构要点 1 每个核小体单位包括200bp左右的DNA和一个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋白H1 2 组蛋白八聚体构核小体的核心结构 由H2A H2B H3和H4各两个分子所组成 3 DNA分子在八聚体上缠绕1 75圈 约146个碱基对 组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bpDNA 锁住核小体DNA的进出端 起稳定核小体的作用 包括组蛋白H1和166bpDNA的核小体结构又称染色质小体 4 两个相邻核小体之间以连接DNA相连 典型长度60bp 不同物种变化值为0 80bp 5 组蛋白与DNA的相互作用主要是结构性的 基本不依赖于核苷酸的特异序列 实验表明 核小体具有自组装 self assemble 的性质 染色体DNA的组装层次 从DNA到染色质 二 RNA的分子结构 一 RNA的类型 二 RNA的结构特征 1 RNA的基本组成单位 AMP GMP CMP和UMP 2 每分子RNA中约含有几十个至数千个NMP 3 RNA主要是单链结构 配对方式 A U及G C 4 稳定性 RNA是单股核酸分子 多核苷酸链自身折叠 缠绕 以碱基互补配对原则 在许多区域形成茎环结构 其二级结构中有许多修饰碱基 RNA单链的折叠 三 参与蛋白质生物合成的三类RNA的结构 转运RNA tRNA 2 信使RNA mRNA 3 核蛋白体RNA rRNA 1 转运RNA tRNA 1 一级结构 10 15 70 90个核苷酸特点 稀有碱基多 分子量小 2 tRNA的二级结构 三叶草形结构 氨基酸臂功能 结合氨基酸 T C环 额外环 可变环 反密码子功能 识别密码子 tRNA的功能活化 搬运氨基酸到核糖体 参与蛋白质的翻译 tRNA的三级结构 倒L形 tRNA三级结构 mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组 在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸 这种核苷酸三联体称为遗传密码 coden mRNA的功能把DNA所携带的遗传信息 以密码子的形式 按碱基互补配对原则 抄录并传送至核糖体 用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序 2 mRNA的结构与功能 特点 含量最少 2 3 种类多 寿命短 代谢最快 遗传密码表 原核细胞mRNA的结构特点 先导区 翻译区 多顺反子 末端序列 真核细胞mRNA分子分为五部分帽子 5 非编码序列 前导序列 编码序列 3 非编码序列 拖尾序列 和尾巴 大多数真核mRNA的5 末端均在转录后加上一个7 甲基鸟苷 同时第一个核苷酸的C 2也是甲基化 形成帽子结构 m7GpppNm 大多数真核细胞mRNA在3 末端有一段长约20 200核苷酸的polyA polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的 真核生物mRNA的前体是核不均一RNA 经过切除内含子 拼接外显子的加工 形成成熟的mRNA 帽子结构 5 cap的功能 1 防止mRNA被核酸酶降解 2 为mRNA翻译活性所必需 3 与蛋白质合成的正确起始有关 polyA的功能 1 保护mRNA 免受核酸外切酶的作用 2 与翻译有关 没有polyA翻译活性降低 3 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关 3 rRNA的结构 特点 含量最多70 80 甲基化多 种类 原核 23S 16S 5S 真核 28S 18S 5S 5 8SrRNA的功能参与组成核蛋白体 作为蛋白质生物合成的场所 大肠杆菌5S与16SrRNA的二级结构 核蛋白体的组成 4 其他小分子RNA 除了上述三种RNA外 细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA 统称为非mRNA小RNA smallnon messengerRNAs snmRNAs snmRNAs的种类核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小片段干涉RNA snmRNAs的功能参与hnRNA和rRNA的加工和转运 微小RNA MicroRNA 和小干涉RNA siRNA RNA干扰 RNAi 近年来的研究表明 将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA dsRNA 导入细胞 可以使mRNA发生特异性的降解 导致其相应的基因沉默 这种转录后基因沉默机制 post transcriptionalgenesilencing PTGS 被称为RNA干扰 RNAi MicroRNAsiRNA MicroRNA miRNA 微RNA 是内源性的 是一种非编码的RNA 由miRNA基因表达出最初的pri miRNA分子 长度为22nt左右的5 端带磷酸基团 3 端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族 Structureofpri miRNAs Pri miRNAsbearthe5 capand3 poly A tails miRNAprocessing Pri miRNA miRNA初级转录产物 Drosha 1 pre miRNA miRNA前体 Dicer 2 miRNA Exportin5 Exp5 transportspre miRNAtothecytoplasm miRNA 通常是外源的 是病毒感染或人工插入的dsRNA经过Dicer酶 切割形成双链小片段RNA 由约20个碱基对组成 注 病毒入侵 或者是自身合成RNA中出现错误 细胞内就会产生双链RNA 来阻止这些异常基因的表达 小的干涉RNA siRNA 1 起始阶段 是较长dsRNA在ATP参与下被RNase 样的特异核酸酶切割加工成21 23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA siRNA siRNA又被称为引导RNA guideRNA 是识别靶mRNA的标志 siRNA的生成启动了RNAi反应 2 效应阶段 是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链 并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 RISC 第三节核酸的理化性质 一 核酸的分子大小二 核酸的溶解度与粘度三 核酸的酸碱性质四 核酸的紫外吸收五 核酸的变性 复性和杂交 一般理化性质 目前核酸的分子量用电子显微镜照相 放射自显影凝胶电泳等技术来测定 DNA分子极大 分子量在106以上 RNA的分子比DNA分子小得多 核酸分子的大小可用长度 核苷酸对 或碱基对 数目 沉降系数 S 和分子量等来表示 部分核酸分子量和核苷酸数 一 核酸的分子大小 稳定性天然DNA分子长度可达几厘米 而分子直径只有2纳米 这种细丝状的双螺旋结构使DNA在机械力作用下极易发生断裂 RNA分子量小 同样条件下不易断裂 纯的DNA白色纤维状固体 纯的RNA白色粉末状固体 DNA和RNA微溶于水 其钠盐在水中的溶解度较大 能溶于2 甲氧乙醇 不溶于乙醇 乙醚和氯仿等有机溶剂中 实验室中常用乙醇沉淀核酸 当乙醇浓度达50 时 DNA就沉淀出来 当乙醇浓度达75 时RNA也沉淀出来 核苷是无色的晶体或粉末 熔点较高 在水中的溶解度嘧啶核苷比嘌呤核苷大 在有机溶剂中一般不溶解 二 核酸的溶解度与粘度 DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白 两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同 DNA核蛋白难溶于0 14mol L的NaCl溶液 可溶于高浓度 1 2mol L 的NaCl溶液 而RNA核蛋白则易溶于0 14mol L的NaCl溶液 因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白 由于DNA分子的极度不对称性 因此DNA溶液的粘度极高 比RNA溶液大得多 当核酸溶液因受热或在其他因素作用下发生解旋时 粘度会降低 高粘度 旋光性 戊糖有不对称的C原子 使其具有旋光性 核酸的磷酸基具有酸性 碱基具有碱性 因此 核酸具有两性电离的性质 但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性 其等电点偏酸性 DNA的pI约为4 5 RNA的pI约为2 0 2 5 在pH7 8电泳时泳向正极 三 核酸的酸碱性质 酸水解 核酸中的糖苷键和磷酸酯键可被酸水解 糖苷键的稳定性小于磷酸酯键 嘌呤碱的糖苷键稳定性小于嘧啶碱糖苷键 实验室利用这一特点 通过酸水解测定DNA中的脱氧核糖和RNA中的核糖 进行DNA 二苯胺法 和RNA 地衣酚法 含量测定 碱水解 在温和的碱性条件下 0 3mol LKOH 水解1小时 RNA的磷酸二酯键发生水解 生成2 3 环核苷酸 延长反应时间 12 18小时 进一步生成2 核苷酸和3 核苷酸 DNA在此条件下稳定不发生水解 这是因为RNA的核糖上有2 OH 在碱的作用下易形成磷酸三酯 磷酸三酯极不稳定 随即水解成2 3 环核苷酸 DNA为2 脱氧核糖 因此对碱有抗性 利用此原理可将DNA中的RNA除去 酶水解 水解核酸的酶很多 根据专一性不同分磷酸二酯酶 非特异性水解磷酸二酯键 和核酸酶 特异性水解磷酸二酯键 核酸的最大吸收波长260nm 260nm 四 核酸的紫外吸收 吸收 光吸收基团 碱基原因 碱基有共轭大 键 由于核酸中嘌呤碱基和嘧啶碱基具有共轭双键 所以核酸在紫外区具有强烈的吸收性能 最大吸收值在260nm处 这可作为核酸及其组份定性和定量测定的依据 核苷酸 RNA DNA紫外吸收的区别 游离核苷酸 RNA或单链DNA DNA 纯DNA A260 A280 1 8纯RNA A260 A280 2 0 根据A260 A280的比值判断核酸样品的纯度 纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量 有些理化因素会破坏核酸的氢键和碱基堆积力 使核酸分子的空间结构改变 从而引起核酸理化性质的生物学功能改变 这种现象称为核酸的变性 五 核酸的变性 复性和杂交 变性不破坏DNA的共价键结构 只是破坏DNA的氢键和碱基堆积力 变性DNA 正常DNA 1 紫外吸收增加增色效应 DNA变性过程中 其紫外吸收增加的现象 变性后的特点 2 粘度下降 变性因素 强酸碱 有机溶剂 高温等等 热变性和变性曲线 Tm 变性温度 熔点 解链温度 加热DNA溶液 使其对260nm紫外光的吸收度突然增加 达到其最大值一半时的温度 就是DNA的变性温度 融解温度 Tm 不同DNA的Tm值不同 一般在82 95 之间 曲线说明DNA变性是爆发式 50 Tm Tm Tm PolyA T 影响因素 1 G C含量 DNA polyG C 2 DNA的复杂程度 均一性 均一性好 则熔解温度范围窄3 介质的离子强度 离子强度高 则Tm值高 复性 变性DNA在适当条件下 可使两条彼此分开的链重新由氢键连接而成的双螺旋结构 这一过程叫复性 特点 紫外吸收减少减色效应 DNA复性过程中 紫外吸收减少的现象常用的复性方法 退火 温度缓慢降低 使变性的DNA重新形成双螺旋结构的过程 概念 DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程 包括DNA DNA杂交DNA RNA杂交RNA RNA杂交原因 不同核酸的碱基之间可以形成碱基配对用途 是分子生物学研究与基因工程操作的常用技术 三 核酸杂交 DNA DNA杂交双链分子 不同来源的DNA分子 第三节 核酸的分离提取和纯化 核酸的纯化方法 为保持核酸的生物活性 分离 分析必须在温和条件下进行 防止过酸 过碱 强烈搅拌 核蛋白的提取 真核细胞中DNA常和组蛋白结合以核蛋白形式存在 把真核细胞捣碎后加入0 9 NaCl和0 01M柠檬酸钠溶液 使DNA蛋白质沉淀 而柠檬酸钠是起抑制DNA的降解作用 核酸与蛋白质的分离 利用核蛋白溶于1mol LNaCl的性质 将其从细胞匀浆中分离出来 用饱和苯酚等溶剂与上述核蛋白共振 冰冻离心 DNA溶于上层水相中 变性蛋白留在酚层内 在水相加入2 5倍体积无水乙醇 将其沉淀出来 再以核酸酶水解以除去RNA 最后借助密度梯度平衡超速离心法或层析柱法 分离DNA DNA的分离 DNA的精制 制得的DNA中还含少量蛋白质等杂质 将它溶解在蒸馏水中 加入阴离子去污剂硫酸十二酯钠进一步作用于DNA和蛋白 使蛋白质与核酸分离而沉淀 通过高速离心去掉蛋白质 在上层DNA溶液加入95 乙醇沉淀DNA 经过乙醇重复洗几次 可得DNA精制品 核蛋白的提取 将细胞破碎制成匀浆 再用0 14mol LNaCl溶液将细胞质的核糖核蛋白体抽提出来 留下含DNA的细胞核组织 核糖核蛋白可在pH4 5溶液中沉淀析出 核酸和蛋白质的分离 含水的酚能沉淀蛋白质 核酸和多糖则溶于水层 水层中的RNA和多糖可被乙醇沉淀 将沉淀再溶于磷酸盐缓冲液 然后用 甲氧乙醇抽提RNA 用乙醇沉淀得RNA RNA的分离 RNA的精制 在粗制的RNA中加入磷酸盐 醋酸盐 乙二醇甲醚并搅拌 使多糖类物质溶于水里 R