转录水平检测甲胎蛋白5ppt课件.ppt

分子生物学第四次讨论 LOREMIPSUMDOLOR 甲胎蛋白基因 alpha fetoprotein AFP GenBank登录号 NM 001134 1 的异常表达与肝癌 前列腺癌等恶性肿瘤有关 请根据基因表达的检测方法 设计实验方案从转录水平检测AFP的表达情况 实验方案包括 实验目的 实验方法及原理 技术路线 可能的结果分析及应用等 讨论题目 甲胎蛋白是人胚胎期血清中的主要蛋白成分 甲胎蛋白是一种糖蛋白 正常情况下 这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞 在胎儿13周AFP含量占血浆蛋白总量的1 3 胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失 在妊娠30周达最高峰 以后逐渐下降 出生时血浆中浓度为高峰期的1 左右 约40mg L 在周岁时接近成人水平 正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克 升 如在成人血清中含量过高 则提示有肝癌的可能 甲胎蛋白 alpha fetoprotein AFP 1 掌握RT PCR技术 northern印记杂交的原理和方法2 了解实验的操作方法和步骤3 判断基因在转录水平的表达情况 实验目的 使用细胞RNA提取技术 然后通过逆转录合成cDNA PCR扩增 利用琼脂糖凝胶电泳技术 测定AFPmRNA的表达 逆转录PCR 是将RNA的反转录 RT 和cDNA的聚合酶链式扩增 PCR 相结合的技术 首先提取组织或细胞中的总RNA 以其中的mRNA作为模板经反转录酶或随机引物的作用从RNA合成cDNA 再以cDNA为模板 扩增合成目的片段检测基因表达 实验方法及原理 1 提取mRNA2 反转录 DNA链3 PCR扩增4 凝胶电泳5 结果显示 实验技术路线 1 若有AFP基因表达 则在与其反转录cDNA链分子量平行处应有检测信号 2 若AFP基因未表达 则在与其反转录cDNA链分子量平行处没有检测信号 结果分析 Northern印迹杂交是指将RNA变性及电泳分离后 将其转移到固相支持物上 然后利用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小的过程 RNA印迹技术正好与DNA相对应 故被称为Northern印迹杂交 与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot Northern印记杂交实验原理 1 若出现明显杂交带 则表明细胞组织内有AFP基因的表达 则会有患肝癌的风险 2 若没有出现明显杂交带 则表明细胞组织内基因未表达 结果分析 Northern印迹杂交技术检测mRNA表达水平的敏感性较PCR技术低 但其特异性强 假阳性率低 因此被认为是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一 RT PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级 使一些极为微量RNA样品分析成为可能 Northern印记杂交与PCR方法的比较 诊断原发性肝癌 检测AFP的含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一 由于肝癌的癌细胞能合成或分泌较多的AFP释放入血的缘故 正因为如此 医生们就把检测人体血液中的AFP作为诊断肝癌的重要依据 并把AFP称为 肝癌标志物 检测AFP是诊断肝癌的一种简便 灵敏 快捷的方法 现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值 用AFP诊断肝癌的 专一性 仅次于病理学检查 血清AFP升高 还可出现于畸胎瘤 睾丸和卵巢肿瘤等 急性肝炎和肝硬化的鉴别诊断肝细胞再生时期 AFP在血液中呈阳性 急 慢性肝炎 肝硬化时会有肝细胞再生 因而AFP在血液中的浓度升高 一般急性肝病 可随病情好转AFP含量下降或正常 肝硬化可呈下降或持续低水平 肝癌则逐渐上升 应用 临床意义 先天性疾病的诊断先天性疾病的诊断 检测羊水中AFP含量的意义已引起注意 Rendle用放射免疫法检测 发现无脑儿羊水中含量显着升高 正常妊娠12 16周羊水AFP含量为21 1 1 2mg L 以后逐月下降 足月时为0 5 0 2mg L 无脑儿患者在妊娠26 31周为95 7 19 3mg L 32 38周为25 7 5 9mg L 先天性肾病及脊柱裂也有类似报道 因此用放免法检测羊水中AFP含量 有助于某些先天性疾病的出生前诊断 母体血中AFP升高还可见于异常妊娠 如