复合PCR测定ABO血型.docx

复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型文章来源：2006-7-18 15:40:03复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型中华医学遗传学杂志 1999年第2期第0卷 技术与方法作者：杨庆恩朱传红单位：杨庆恩（430030 武汉，同济医科大学法医学系）；朱传红（武汉市刑事科学技术研究所）关键词：ABO血型；基因型；聚合酶链反应；限制酶【摘要】目的研究复合聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分型人类ABO基因型。方法在每一个反应管内同时扩增ABO糖基转移酶基因中2个特异性片段，然后于同一管内进行Kpn 和Alu 限制酶消化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，对武汉地区125例汉族无关个体作ABO基因型分型。结果ABO的6种基因型分型明确，125例汉族人ABO基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论该方法操作简单，分型明确，重复性好，适用于法医学鉴定。Detection of ABO genotypes by simultaneous PCR-RFLP methodYANG Qingen*, ZHU Chuanhong.*Department of Forensic Medicine, Tongji Medical University,Wuhan430030P.R. China E-mail:fywz 【Abstract】ObjectiveTo study human ABO genotyping by means of multiplex PCR and restriction fragment length polymorphism. MethodsTwo specific fragments of ABO gene were simultaneously amplified in a single tube, and then the double restriction digestion with RE Kpn and Alu was performed in the same tube. The amplified products were analyzed by PAGE and silver staining. 125 Han unrelated individuals living in Wuhan were genotyped.ResultsSix genotypes of ABO were detected and the distribution was in good agreement with Hardy-Weinberg equilibrium.ConclusionThe results demonstrate that PCR-RFLP based approach is convenient, reliable and should be of value in forensic application.【Key words】ABO blood groupGenotypePolymerase chain reactionRestriction fragment polymorphismABO血型是发现最早、应用最广泛的人类血型，ABO血型物质广泛地分布在人体组织和体液中。1990年，Yamamoto等1报道了ABO系统的糖基转移酶基因碱基序列分析结果，提出了应用PCR扩增和等位基因特异性限制酶消化检测ABO基因型的方法。随后Lee等2、Crouse等3、Ladd等4、Akane等5、Herrin等6相继报道了ABO基因型测定方法。经过比较，我们选择Herrin方法，采用2对引物复合扩增ABO糖基转移酶基因中的2个区段，限制酶Kpn 和Alu 同时消化扩增产物，PAGE和银染，获得ABO系统的6种基因型图谱。对125例汉族无关个体ABO基因型进行调查，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，现报告如下。1材料与方法1.1样本从武汉市同济医院血库随机收集125例健康成人EDTA抗凝血，经血清学方法测定，其中A型43例、B型32例、O型41例和AB型9例。全血样用细胞裂解蛋白酶K法提取DNA，-30保存备用。1.2引物由Bio-Tech公司合成，引物序列为：引物1：5-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3；引物2：5-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3；引物3：5-GTG-GAGATCCTGACTCCGCTG-3；引物4：5-CACCG-ACCCCCCGAAGAA-3。1.3PCR扩增反应体积25l，其中含1.5mmol/L MgCl2，1缓冲液，200mol/L dNTP，200g BSA，1.25U Taq DNA 聚合酶，引物1、2各125pmol/L，引物3、4各62.5pmol/L，模板DNA 8l。扩增热循环参数：95 2分钟；95 30秒，60 10秒，72 45秒，共30个循环；72延伸10分钟。1.4酶切消化扩增产物中直接加入Kpn 和Alu各2.5U，置37孵化30分钟。1.5垂直PAGE分离和银染电泳用T6%，C5%聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)内含尿素4mol/L、0.5TBE，电泳条件恒压550伏，40分钟。设置pBR322/Msp分子量标准作对照。银染按余纯应等7方法。1.6统计学分析125例血样分型并记录基因型，对基因型频率分布作2检验。2结果2.16种基因型谱带清晰分型明确。6种基因型的复合扩增产物均由200(199)bp和159bp两条带组成。但经酶切消化后共出现4种特异型片段长度：片段1为200(199)bp、片段2为171bp、片段3为159bp、片段4为118bp。6种基因型判定：片段1+3为AA型，片段1+2+3为AO型，片段1+3+4为AB型，片段1+4为BB型，片段1+2+3+4为BO型，片段2+3为OO型(图1)。图1ABO基因型谱型16：未作限制酶消化前扩增产物；712：限制酶Kpn 、Alu 消化后Fig 1Patterns of ABO genotypes by PCR-RFLP1-6: Amplification products before RE digestion;Lanes 7-12:After RE digestion; M:pBR322/Msp; 1,7:AB; 2,8:OO; 3,9:BB; 4,10:BO; 5,11:AA; 6,12:AO2.2武汉地区125例汉族无关个体基因型分布及基因频率见表1。表1汉族人群ABO基因型分布Tab 1Genotype distribution of ABO in Han populationGenotype(基因型)No. obs.(观察值)(%)No.exp.(期望值)2Gene frequency(基因频率)AB9(7.20)10.740.2819A=0.214B=0.176O=0.580OO41(32.80)42.050.0262BB3(2.40)3.870.1956BO29(23.20)25.520.4745AA9(7.20)7.440.3271AO34(27.20)35.380.0538Total(合计)125(100.00)125.001.3591df=3,P0.503讨论Yamamato等1，8从不同ABO型别的结肠癌患者的细胞株SW948、SW48、COLO205和SW1417中提取poly(A)-RNA，与gt10构建4个cDNA文库。经过筛选、测序后发现A基因和B基因之间有7个单碱基替换：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。而O基因在靠近N端出现258G单碱基缺失，形成移码变异，编码出无糖基转移酶活性的蛋白质。其后作者又研究了14例具不同ABO型个体的血样和细胞株，确定A、B基因之间的3个单碱基替换以及O基因258G缺失形成的等位基因特异性限制酶识别位点。我们选择的2个特异性限制酶识别点为G700A和258G缺失。引物1和2扩增片段200(199)bp，包含258位碱基。A、B基因扩增片段200bp，O基因扩增片段199bp，因O基因258G缺失构成Kpn 识别点，酶切后为171bp和28bp，故171bp片段出现则说明有O基因。引物3和4扩增片段159bp，包含700位碱基，A、O基因均为700G，仅B基因为700A，构成Alu 识别点，酶切后产生118bp和41bp，所以118bp片段出现说明有B基因(图2、表2)。我们选择方法的特点是在同一反应管里复合扩增2条特异性片段，扩增产物同时用2种限制酶消化，操作比较简单，且能节约模板DNA量。125例血样基因型检测与血清学检测结果全部吻合，证实本法分型稳定，重复性良好。电泳分离改用PAGE，经银染显示结果，提高了检测灵敏度，分型结果可长期保存。表2ABO基因型谱带Tab 2Interpretation of ABO genotype by RFLPGenotype(基因型)Amplication with primers 1 and 2,digestion with Kpn (引物1+2扩增，Kpn 消化)Amplication with primers 3 and 4,digestion with Alu (引物3+4扩增，Alu 消化)Digestion pattern(消化形式)Visible bands(可见片段)(bp)Digestion pattern(消化形式)Visible bands(可见片段)(bp)ABNo digestion2001/2 digestion159,118OOCom.digestion171No digestion159BBNo digestion200Com.digestion118BO1/2 digestion200,1711/2 digestion159,118AANo digestion200No digestion159AO1/2 digestion200,171No digestion159* No digestion：无消化, 1/2 digestion：半消化, Com. digestion：全消化；Products of 28bp and 41bp digested by RE Kpn and Alu ran off the gel：Kpn 消化产物28bp以及Alu 消化产物41bp已泳出凝胶图2A、B、O基因特异性限制酶识别点Fig 2Partial sequence of the ABO locus and cleavable site by RE Alu and kpn125例汉族无关个体ABO基因型分布见表1。基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P0.50)。A、B和O基因型频率分别为0.244、0.176和0.580，与湖北地区血清学分型36 932例的调查结果相吻合(P0.05)9。基因型测定能够鉴别BB和BO型，AA和AO型，因此法医学个体识别能力应高于血清学检测，依本次调查结果计算，Dp值为0.7536，略高于常规血型测定。基因型分型检测材料是基因组DNA，法医学个体识别应用范围广泛，如ABO非分泌型的体液斑痕，提取其中体细胞DNA，则可鉴定其ABO基因型。复合PCR-RFLP技术为法医学ABO型鉴定提供一新的方法。分型测定中，限制酶液宜新鲜配制，低温保存备用。研究中我们发现反复冻融可使限制酶活性下降，使酶消化不完全，OO型出现未消化完的199bp片段而误判为AO型；BB型出现159bp被误判为AB型。因此在实际应用时建议设置已知O型和BB型血样作对照，可避免因酶活性下降造成的误判。其次，限制酶工作液应低温保存，使用时间不超过1周为好。参考文献1Yamamoto F, Clausen H, White T, et al, Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature, 1990, 345(17)229-233.2Lee JCI, Chang JG. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J Forensic Sci，1992，37（5）1269-1275.3Crouse C, Vincek V. Identification of ABO alleles on forensic-type specimens using rapid-ABO genotyping. Bio Techniques, 1995, 18(3)478-483.4Ladd C, Bourke MT, Scherczinger CA, et al. A PCR-based strategy for ABO genotype determination. J Forensic Sci, 1996, 41(1)134-137.5Akane A, Yoshimura S, Yoshida M, et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. J Forensic Sci, 1996, 41(2)272-274.6He