促红细胞生成素减轻脑缺血机制损伤研究的进展.doc

促红细胞生成素减轻脑缺血机制损伤研究的进展摘要：促红细胞生成素(Erythropoietin, Epo )是一种主要影响红细胞生成的细胞因子，是一种含唾液酸的糖蛋白，主要由肾脏和胎肝合成，是刺激红系祖细胞增殖、分化与成熟的主要细胞因子。Epo分子量为34kD，由165个氨基酸组成。天然的Epo分为两种类型：即碳水化合物含量分别为34%的型和26%的型。显然，其划分依据为碳水化合物的含量多少。人类Epo基因位于7号染色体长臂22区，因此这两种类型的Epo在生物学特性、抗原性和功能完全相同。1985年成功克隆出了它的cDNA，并且利用基因重组技术制成重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rHuEpo)用于临床贫血治疗。随着Epo及其受体(Epo receptor, EpoR)在中枢神经系统表达的发现和深入研究，Epo与中枢神经系统的关系受到研究者的高度重视。研究表明，脑缺血机制损伤后，Epo可发挥抑制细胞凋亡，减轻兴奋性氨基酸的毒性反应，减轻应激和炎症反应等保护作用。关键词：促红细胞生成素脑缺血损伤细胞凋亡机制本文就Epo对脑缺血机制损伤的保护作用综述如下。1 Epo及EpoR在中枢神经系统的分布1.1 正常脑组织内Epo的表达正常脑组织内存在少量的Epo蛋白。Masuda等1第一次在体外培养鼠胚胎脑细胞时发现了细胞自身分泌的Epo，并进一步证实这种Epo在糖基化水平上与血清Epo有很大不同（鼠胚胎脑细胞分泌的Epo与血清Epo相比，含有的唾液酸少、分子小、作用强）。Epo及EpoR的mRNA是Juul等2在利用PCR逆转录技术培养人类胚胎脊髓细胞时检测到的，证实在脑组织中确实存在Epo和EpoR。Nagai3等进一步证实，Epo mRNA存在星形胶质细胞，而EpoR存在于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。由此可以证明脑内Epo的主要生成细胞是星形胶质细胞。Bernaudin4等利用膜片钳和反转录PCR技术发现除了星形胶质细胞外，神经元也是脑内Epo的来源之一。Juul5等利用免疫组织化学技术发现从孕后5周的胚胎到成年，在大脑不同发育阶段的脑组织切片上，神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞均存在Epo及EpoR的特异性抗体。以上研究说明正常情况下，大脑组织内存在内源性Epo及其受体，并参与神经系统功能。1.2 脑缺血机制损伤后Epo的表达许多研究均发现，脑缺血机制损伤时，Epo及EpoR的表达增加。Nagai3等在神经元和星形胶质细胞原代培养的研究中发现，当培养于低氧浓度时，神经元和星形胶质细胞内Epo mRNA的聚集超过正常20100倍，且Epo的生成量同时增加。Shingo6等的研究表明，培养中的神经干细胞在缺氧量适度的环境中比在正常氧环境要多产生23的倍神经元，并且这种现象与Epo基因表达产物增加密切相关。Bernaudin7等还观察了局灶性持续脑缺血小鼠Epo表达的时间和空间分布规律，发现除了神经元，缺血后1天的内皮细胞、3天的小胶质细胞和巨噬细胞、7天的反应性星形胶质细胞均可产生脑源性Epo mRNA。2 Epo的产生与作用机制2.1 脑缺血机制损伤后Epo的产生机制脑内Epo的产生和脑组织供血供氧情况密切相关，即氧张力可以很大幅度的调节脑源性Epo的生成。具体调节机制如下：当脑部形成缺氧坏境时，Epo与EpoR的比值可大幅度上调，以一种对缺氧正常生理反应的早期介质的角色而发挥相应作用，这是机体生理性自我保护机制的一个重要组成部分。在 Epo生成量逐渐增多的过程中，缺血半影区内神经细胞EpoR的表达速率也明显上调，进一步加强了Epo的作用效果。但是，但脑缺血机制收到伤害时，在其局部会生成缺氧反应因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)，HIF-1穿越各膜层进入细胞核并与染色体上的缺氧反应成分(hypoxia response element, HRE)结合起来，进而包括葡萄糖转运蛋白，糖酵解酶系，血管内皮生长因子(VEGF)以及Epo等在内的一系列基因的转录。此外，研究还发现Epo的生成过程中还需要其它因素参与。(1) H2O2是Epo生成调节过程中的胞内信号分子,即当胞内H2O2含量较高时Epo的表达受抑制，反之抑制解除Epo表达增强。推断依据如下：Fandrey等8用肝细胞癌HepG2进行体外实验时发现，胞浆内的H2O2在缺氧环境下或在培养基中加入还原性物质（氯化钴(CoCl2)、去铁胺(DSF)、NADPH等）时其含量会明显下降，Epo表达反而明显增多；但当直接加外源性H2O2于培养基中时，Epo表达则明显减少。(2)细胞内线粒体的影响：Chandel等9用肝细胞癌Hep3B体外培养实验进一步证实，由于缺氧而造成的Epo生成增加过程中需要线粒体的参与。当细胞内缺氧时在线粒体的作用下，增加了胞内的自由基活性氧(ROS)，从而引起Epo表达的增加；去除Hep3B细胞线粒体后，Epo对缺氧的反应性也相继消失了。(3)神经元和神经胶质的细胞内氧化-还原状态的改变也能促使Epo表达增加4。Gossmann等10发现Epo的产生增加现象在用血管紧张素II (Ang II)作用血管紧张素I型受体(AT1R)时也出现了，具体的发生机制尚未研究清楚。2.2 Epo的信号转导Epo介导的细胞内信号转导的第一步：激活Jak2酪氨酸激酶活性。当Epo与其受体EpoR结合后，在一个由20个氨基酸组成的片段的引导下EpoR会发生同种二聚反应，与EpoR相连的两个Janus激酶(JAK2)和一个酪氨酸激酶也和EpoR的细胞内区域相结合，从而缩短了它们之间的距离11，激活了Jak2酪氨酸激酶的活性。第二步：Jak2在EpoR含Box 1基序的穿膜区附近12与EpoR相结合激活EpoR从而导致EpoR自身磷酸化。被磷酸化的酪氨酸残基的共同特点是：它们的本质是具有SH2同源域的蛋白结合位点。一般情况下，EpoR胞浆区内的8个酪氨酸残基都具有这种特点，因此都可被磷酸化。被磷酸化后的EpoR的酪氨酸残基会吸引其它细胞内蛋白质去结合EpoR13，之后这些蛋白质依次被激活，进而参与下游信号的转导。应用体外大脑缺血损伤模型Ruscher等14证明JAK2的抑制剂AC490可降低Epo对大脑缺血损伤的保护能力。PI-3K的抑制剂LY294002可抑制EPO的保护作用和有促凋亡作用Bad的磷酸化（提示：EPo和EpoR结合后激活了JAK2、PI-3K而发挥神经保护作用，PI-3K又通过PKB/AKt介导的磷酸化作用灭活Bad，抑制了神经凋亡。Bad是一种促凋亡因子，位于线粒体外膜上）。如今发现细胞凋亡的主要原因之一是：细胞受损后的凋亡与线粒体功能变化关系很大，虽然现在并没有完全弄明白受损后的细胞凋亡机制具体是什么，但可以肯定的是原来位于线粒体内膜的细胞色素C释放到胞浆，激活了Caspase-9，并进一步激活了Caspase-3。有学者研究15证明：在新生鼠缺氧缺血脑损伤区有激活的Caspase-3。另有学者报道16, 17：EPo的神经细胞保护作用是通过激活PKB，使Bad磷酸化，保持了线粒体膜电位的稳定，从而抑制了细胞色素C的释放和Caspase-8、1、3的激活进而达到起到保护作用、抵抗细胞凋亡。核因子-B(nuclear factor NF- B)的定义为：它是一种核转录因子，调控细胞凋亡、炎症等多种过程基因的表达。可分为两种状态：一是未被激活状态即通过与它的抑制蛋白（I- B家族的成员）结合形成复合物并以该形式存在与胞浆中；另一种为激活状态，NF- B被激活后I- B磷酸化并与NF-B解离，之后NF- B穿膜进入细胞核与细胞凋亡、炎症等多种过程中相关基因的靶序列结合从而调控该基因的表达。Murat等18通过研究发现NF- B在Epo的神经细胞保护作用中起了重要作用，具体机制如下：Epo与EpoR结合后激活了JAK2-STATS途径，同时激活的JAK2使I- B磷酸化，I- B与NF- B解离，NF- B从胞浆转移到胞核导致包括XIAP和C-LAP2等凋亡抑制因子在内的NF- B依赖性神经保护基因的转录，这些凋亡抑制因子通过抑制Caspases的激活从而抑制了细胞凋亡。此信号转导过程有多条途径。已证实的信号传导途径除此之外还有：(1)EpoR-JAK2-ERKs(胞外信号调节激酶-1，2)途径19；( 2 ) EpoR-JAK2-Ras(Ras蛋白升MAPK(有丝分裂原活化蛋白激酶)途径19, 20等。由此可知：Epo胞内信号传导是由多个通路错综交连形成的复杂网络传导过程，而不是单一的级联通路。2.3 Epo与血脑屏障早先，Marti21和Juul22的研究成果使很多学者以为Epo是一种不能穿过血脑屏障的大型糖蛋白，因此静脉注射rHu-Epo时Epo的含量不会发生太大变化，脑源性Epo也不会进入血液循环。前者认为具有血管收缩的作用的Epo直接起源于大脑，在没有明显损伤时，产生于肾脏的Epo不会穿越血脑屏障引起脑脊液基础成分的变化；后者也用实验证实Epo存在于足月及早产儿的脑脊液中，用重组Epo治疗的新生儿的CSF中的Epo浓度和未曾治疗过的差别不大，从而推测Epo不能通过完整的血脑屏障且在脑中以自分泌或旁分泌的方式发挥作用。另有观点称，血脑屏障在脑缺血受损后Epo是可以透过的。同时有报道称，在局部脑缺血之前或脑缺血6h以内静脉注射Epo alfa，可以减小50%70%损伤，静脉注射Epo可以发挥CNS的保护作用。最近研究表明Epo是一种能被选择性转运的大分子物质的可能性非常大；已经有研究证明23：人和哺乳动物的脑部微血管内及周围存在着全部的 Epo-R；并且通过透射电镜已经在微血管周围星形胶质细胞的终足内与微血管内皮细胞内和表面发现了Epo的免疫反应呈现优势23。以上研究结果均提供了在缺乏神经损伤时，Epo可由血液循环透过血脑屏障进入脑实质的解剖学基础。生物素标记rHu-Epo的实验充分说明了Epo可以透过血脑屏障，该试验的结论是：存在于微血管周围的标记rHu-Epo进入了脑实质，大量非标记的rHu-Epo的联合注入明显减少了生物素标记的rHu-Epo数量，符合一种特殊的可饱和的转运机制。现在，对于Epo是否可以在正常情况下穿透血脑屏障观点仍然不同意，但大多数学者及研究成果的观点结论均趋向前者。3 Epo对脑缺血机制损伤的保护作用3.1 Epo与细胞凋亡Juul2等先在1%氧浓度条件下分别持续培养人类神经元前体细胞(NT2 )及其成熟体细胞(hNT)24、36或48小时后再于正常环境下培养24小时，有21.5%的细胞的DNA没有断裂，而将生理剂量(5Ug/ml) Epo加入培养基中24小时后发现没有发生DNA断裂细胞数量增加到50.5%，该试验证明Epo可以阻止细胞凋亡。Kumral等24在新生鼠缺氧缺血脑损伤模型中采用TUNEL法检测凋亡细胞时发现，外源性EPo腹腔注射后，Epo处理组损伤脑组织区神经细胞凋亡明显减弱，提示EPo有明显的抗凋亡作用。Siren等20用鼠的大脑中动脉闭塞(MCVO)模型，在缺血半暗区使用TUNEL法检测Epo的抗凋亡作用，发现缺血半暗区TUNEL阳性细胞减少了很多，并且同时发现MCVO后24h梗死面积明显减少，详细说明了Epo通过阻滞神经细胞程序性死亡而起到保护神经细胞的机制。同时还发现在纯净的及混合的神经细胞培养基中，Epo (0.110.0U/ml )可以维持血清含量防止其丧失并可以组织因红藻酸暴露所致的凋亡。保护作用需预先处理，这与诱导基因表达相一致，当Epo不能持续存在时保护作用也可持续一段时间。近来有学者25还发现Epo与胰岛素样生长因子-1通过磷酸肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI-3K)途径具有协同抗神经细胞凋亡作用。Chen等19还发现Epo能够以最快的速度使原癌基因c2myc开始表达，阻止细胞凋亡并且维持细胞的存活。3.2 Epo与兴奋性氨基酸毒性反应细胞死亡的主要原因被认为是脑缺血机制损伤后兴奋性氨基酸毒性的反应。利用放射配基结合技术研究兴奋性氨基酸受体的分布实验表明，兴奋性氨基酸如谷氨酸与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体分布的高密度区和脑缺血性易损区高度相似。此受体与AMPA结合引起钙通道开放，从而导致胞内钙超载、神经元细胞凋亡或坏死。Morishita等26的实验结果显示暴露于Epo的实验组神经元死亡率大大少于对照组并且Epo对谷氨酸诱导神经元死亡的阻止作用在很大程度上依赖于所用剂量。实验还发现但先在放线菌D(mRNA合成抑制剂)中加入Epo时，Epo的神经保护性作用可因放线菌酮(蛋白合成抑制剂)而丧失。以上结果暗示：Epo发挥其神经保护作用必需mRNA及蛋白合成。这一点在Sinor等27的研究中也得到了证实。让培养的鼠的皮质神经元和星形胶质细胞放在缺氧并暴露于兴奋性氨基酸中时，Epo (30pm)可减少由于缺血缺氧所造成的神经元坏死及由AMPA受体调节的兴奋性氨基酸神经毒性作用，该实验提示由脑缺血导致的、受AMPA受体调节的神经细胞的坏死可受到Epo的保护。还有研究显示Epo能减轻NMDA受体拮抗剂-MK801所诱导的神经凋亡作用28。Kawakami等29的研究表明，对小脑颗粒细胞培养时，Epo可以使钙离子诱导的谷氨酸释放量减少，这种抑制也可由Epo的模拟肽1 ( EMP1)产生，同时发现：在早期阶段，谷氨酸释放时通过突触小泡内容物的胞吐作用，因为这种释放方式可被肉毒B型神经毒素(BoNT/B)阻断；后期阶段谷氨酸的释放通过一个对BoNT/B不敏感的非胞吐途径，而EMP1对谷氨酸释放的抑制作用仅在早期阶段发生。相关研究表明，海马的缺血可以引起海马CA 1区和齿状回神经元的细胞死亡，该死亡可被EMP1阻断，但EMP1对外源性谷氨酸所诱导的神经元的死亡不起作用。以上提及的种种研究表明，可通过抑制谷氨酸的胞吐作用激活Epo-R从而部分抑制缺血细胞的死亡，但要想实现完全抑制作用，需要同时使用其他药物来对谷氨酸的释放进行抑制。3.3 Epo与细胞内钙超载Masuda30等最早发现将Epo加入PC12细胞系培养基中可在短时间内引起钙内流。Koshimura等31通过进一步研究发现当Epo与PC12细胞结合时，可使PC12细胞去极化，细胞外游离的钙迅速向细胞内流去，细胞内钙浓度迅速增加，这一过程深受剂量的影响。Epo增加了PC12细胞有丝分裂原蛋白激酶的活性，增大了多巴胺及酪氨酸羟化酶活性增加的速率，从而增加了体外培养神经元的生长速度。钙离子拮抗剂尼凡地平、抗Epo抗体及钙鳌合剂都能阻断由Epo引起的钙浓度增加现象，使Epo保护作用丧失。除此之外，Epo还能使膜的去极化。Assandri等32在更高水平上运用成神经细胞瘤系SK-N-MC细胞作为体外的神经细胞模型，并通过激光扫描显微技术分析方法证实，外源性Epo与Epo受体结合后作用于SK-N-MC细胞，并通过T型电压依赖钙通道、或/和非电压依赖性钙通道、或/和NMDA受体通道短暂增加细胞外钙内流，使细胞内钙浓度增加；用T型电压依赖钙通道阻滞剂可使 Epo保护作用消失。并由此认为，Epo发挥保护作用可能通过激活钙通道作为始动因素。有实验说明33，Epo引起的通过依赖性L型钙通道的钙内流血管平滑肌细胞的电压可能增加。3.4 Epo与一氧化氮( nitric oxide, NO)合成脑缺血机制损伤时，在诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的诱导下产生的NO是一个重要的炎症介质，在缺血脑组织的中性粒细胞、缺血区血管壁以及星状胶质细胞、小胶质细胞等均有所表达。大量研究证明，NO在脑缺血机制损伤中是把双刃剑，既具有神经保护作用也具有神经毒性作用。一般情况下大家认为，NO对脑的保护作用只在脑缺血机制受损伤的最开始的几个小时内有，然而随着随着再灌注期NO过度合成其作用就向其相反面发展即导致神经毒性作用，并介导NMDA受体诱发谷氨神经毒性作用从而导致神经元损伤。Murat等1的研究结果表明：脑缺氧时突触前膜释放兴奋性氨基酸作用于突触后膜的NMDA受体，导致钙离子内流。细胞内大量的钙离子激活一氧化氮合成酶从而引起NO合成量的增加，通过酶作用形成亚硝化DNA及生成过氧化亚硝酸阴离子，造成神经元细胞坏死或凋亡，最终导致神经毒性作用。Epo在抑制NO过度合成来减轻脑损伤方面有一定的可能性。体外实验34证实提前使用Epo可以阻止NO生成因子硝普钠(SNP)对NO合成的诱导作用从而阻止NO的过度合成，但是Epo不能阻止NMDA受体介导的钙内流，将Epo及SNP一起加入对SNP诱导的神经元细胞损伤也没有减轻作用。Calapai等35应用阻断沙土鼠双侧颈总动脉5分钟后再开通的脑缺血模型进行腹腔内注射rHuEPO (25100U)和脑室内注射rHuEPO( 0.2525U）后观察脑NO合成的变化、脑丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平、脑水肿及海马区神经元死亡情况，发现脑缺血7天后任何一种给药方式都能明显降低海马CA1区神经元丢失、脑水肿和MDA的量，而在缺血后观察到的海马区增多的亚硝酸盐、硝酸盐的数量可在rHuEPO治疗后有所降低。这说明在体内Epo可通过抑制NO的过度合成发挥其神经保护作用。Kumral等36发现在7日wistar大鼠缺氧缺血脑损伤模型中，缺氧缺血导致损伤脑组织中NO水平明显升高，腹腔注射EPO可明显抑制NO的产生，产生神经保护作用。EPO可抑制NO的毒性作用，但有人认为其对NO的水平无影响。目前，EPO对NO水平的影响意见不一，但都证明Epo可通过抑制NO的毒性作用发挥神经保护作用。3.5 Epo与应激、炎性反应Sun等37在7日新生鼠缺氧缺血脑损伤模型实验中发现，Epo预处理可以使脑组织中热休克蛋白-27( heat shock protein 27, HSP27)表达增加，提示HSP27参与了Epo的内源性脑保护机制。Villa等38在通过阻断鼠大脑中动脉造成缺血模型的实验中发现，Epo可抑制炎症反应而发挥神经保护作用，表现在抑制梗死区星形胶质细胞的活性，抑制循环白细胞、小胶质细胞在梗死区的聚集，使缺血导致的炎性因子-肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、单核趋化蛋白-1的浓度降低一半。进一步实验提示炎症反应的减轻是由于Epo减轻了神经元死亡，并不是对有EpoR表达的炎症细胞有直接作用。3.6 Epo与神经营养已经有研究证明：Epo对大鼠胆碱能神经元具有神经营养作用，可以防止大鼠海马神经元由于缺血诱发的死亡，并对培养中的大鼠皮质神经元具有保护作用。Csete等39观察到Epo对多巴胺能神经元具有促分化、增殖和维持细胞系稳定的作用。Lee等40还发现Epo可以诱导神经干细胞分化成星形胶质细胞。在大鼠的卒中模型中观察到，Epo可以通过促进血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子，使卒中后脑组织出现血管新生和神经细胞再生，有利于脑功能的恢复41。此外，Epo可能防止缺血诱导的细胞凋亡使Epo的神经营养作用具有长期保护效果4 Epo临床应用前景目前，Epo在临床上主要用于治疗各种原因的贫血，其中对肾衰、尿毒症伴随的贫血治疗效果最明显。许多实验研究己经证实Epo确实具有神经保护作用，动物实验中也显示出其多方面，多层次的保护效果，但是，必须得在一定的时间内给予Epo。随着对Epo的神经保护作用研究的深入及新型Epo的研制开发，我们相信一定会给进一步探索脑缺血机制损伤的发病机制及临床治疗途径带来新的思路，建立重要的理论基础并创造出巨大的临床价值。参考文献1 贾建平神经病学第六版北京: 人民卫生出版社, 2008171-175.2 Lopez M, Davalos A. 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