霍老师荧光实验.doc

分子荧光光谱分析法测定复合维生素B注射液中VB2的含量1、 实验目的和要求1、 了解荧光光谱分析的基本原理2、 掌握荧光法定量分析方法3、 了解日本岛津RF-5301 PC 型分子荧光光度计的构造和使用方法2、 实验原理常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度F与物质浓度C有以下关系：F=KC当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系，这是荧光光谱法定量分析的理论依据。荧光分析法的特点：（1） 、与紫外-可见分光光度计比较有更高的灵敏度。（2） 、选择性好。（3） 、所需试样量少，操作方法简便。荧光光谱激发光谱激发光谱：固定测量波长，化合物的发射荧光强度与照射光波长呈现一定关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，激发强度最大。发射光谱发射光谱：固定激发波长化合物的发射荧光强度与发射光波长呈现一定关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如液槽显示器单色器检测器I0IIf光源单色器下图所示：维生素B2(又名核黄素)针状结晶体，结构为：3、 仪器与试剂仪器：日本岛津RF-5301 PC 型分子荧光光度计，5mL吸量管一只，2mL吸量管一只，50mL容量瓶8个，100mL烧杯2个，洗瓶一个，玻璃棒两根，蒸馏水。试剂：10.0g/mL (AR)VB2标准溶液,冰乙酸。4、 基本操作1、 打开氙灯，再开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器2、 仪器初始化后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数，激发波长=440nm , 发射波长=540nm.3、 样品测定4、 退出程序，关闭计算机，先关主机再关氙灯。5、 实验步骤：1、标准溶液系列的配置 在6个干净的25 ml容量瓶中，分别吸取0.25、0.50、0.75，1.00，1.25和1.50维生素B2标准溶液，各加入1.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。1、 VB2的荧光光谱的绘制及其标准溶液荧光强度的测定。2、 未知试样的测定称取10uL复合维生素B注射液,用少量水溶解后转入25ml比色管中，加1.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。六、数据处理与分析1、VB2的激发光谱图 在六只干净的26mL 比色管中，分别吸取0.25、0.5、0.75、1.00、1.25和1.50 mL 的VB2 标准溶液，各加入1.00mL 冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。其中 VB2标准溶液浓度为10.0g/mL (AR)从下向上1到6 溶液的浓度依次为：ID123456溶液浓度g/mL 0.250.50.751.001.251.50激发波长=440nm , 发射波长=540nm.2、VB2的荧光标准曲线：由于未知样液的荧光强度FX1=185.833,FX2=187.697;所以未知样液的平均荧光强度 , 由工作曲线可以查的C1x= 0.173134796 g/mL，由于测量的是稀释后的溶液，所以原药品的浓度应该是是稀释后的2500倍。 Cx=0.43283699mg/mL 。 产品标明的含量是=0.2 mg/mL。七、注意事项1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作。2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，