小麦种子淀粉酶酶学性质的研究.doc

小麦种子淀粉酶酶学性质的研究 小麦种子淀粉酶酶学性质的研究Enzymatic properties of amylases from wheat摘要：在小麦种子中提取淀粉酶，研究相关酶学性质，了解温度、PH值以及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响，并且对酶的活力进行测定。不同的温度、PH条件下和加激活剂或抑制剂情况下淀粉酶将淀粉水解的程度不同，产物遇碘呈现不同的颜色，由此可知道酶活性的最适温度和最适PH，也可知道激活剂能使酶的性增加，抑制剂能使酶的活性降低。对酶的活力进行测定时，是测定产物麦芽糖的量，来表示酶的活力。麦芽糖能将3、5二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm处有最大吸收峰），其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比，利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值，从而得到产物麦芽糖的量，来表示酶的活力1。关键词：小麦种子；淀粉酶；温度；PH值；激活剂；抑制剂；酶的活力;分光光度计研究背景：二十一世纪是生物信息时代，各种生物学领域研究层出不穷 ,对酶的研究是其中一个重要方面,目前对酶的研究已转入了后期，各种酶的生化性质也相继被研究出，酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度、pH和离子强度下才具有生物活性,有些酶还需要辅酶或者辅因子2。通过此次实验研究，让我们进一步加深对淀粉酶的认识和学习，同时培养我们设计实验的基本思路，学会科学的实验组合，提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据,也为我们以后更多的设计型实验作好铺垫。目的：通过此次实验研究让我们进一步的加深对淀粉酶的学习和认识。同时，培养我们设计实验的基本思路，学会科学的实验组合，提出合理的实验方案，为研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据，也为设计性实验做好铺垫。意义：生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶有两种功能:其一,催化各种生化反应,是生物催化剂;其二,调节和控制代谢的速度、方向和途径,是新陈代谢的调节元件。酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性;另一种是通过影响酶分子的合成和降解,以改变酶分子的含量。这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节4。现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益5。1 材料与方法1.1材料小麦(Triticum aestivum)东北农业大学生命科学学院生化教研室提供1.2方法1.2.1标准曲线的制作 1.2.2粗酶的提取 称取2克萌发的小麦种子研磨成匀浆，倒入25ml具塞刻度的试管中，用蒸馏水稀释至刻度线处，混匀后在室温下静置，每隔数分钟震荡一次，放置20分钟后，开始离心（4000r/min）10分钟，取上清液备用。1.2.3定性法分析温度对酶活性影响 准备8支试管分别编号A、a、B、b、C、c、D、d，第一步分别在A、B、C、D管中加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸1ml;第二步分别在A、B、C、D管中加入0.3%的NaCl溶液1ml;第三步分别在A、B、C、D管中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml;第四步分别在a、b、c、d管中加入淀粉酶提取液1ml;第五步分别把A、a管放在4冷冻箱中,把B、b管放在室温下,把C、c管放在40水浴中,把D、d管放在沸水浴中,10min钟后把A管中的溶液倒入a管, 把B管中的溶液倒入b管, 把C管中的溶液倒入c管, 把D管中的溶液倒入d管,再把a管放在4冷冻箱中,把b管放在室温下,把c管放在40水浴中,把d管放在沸水浴中,进行酶促反应10min;最后在a、b、c、d管中加入碘液各一滴,并观察颜色变化情况。1.2.4定性法分析PH值对酶活性影响 准备三支试管分别编号、, 第一步在、管中分别加入PH=3.0、PH=5.6、PH=9.6的缓冲液柠檬酸2ml; 第二步分别在、管中加入0.3%的NaCl溶液1ml; 第三步分别在、管中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml;第四步分别在、管中加入淀粉酶提取液1ml;最后各管混匀，放在40水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液1滴，并观察颜色变化情况。1.2.5定性法分析激活剂或抑制剂对酶活性影响 准备三支试管分别编号、, 第一步在、管中分别加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸2ml; 第二步在管中加入0.3%的NaCl溶液1ml，在管中加入0.3%的CuSO4溶液1ml，在 管中加入蒸馏水1ml; 第三步分别在、管中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml;第四步分别在、管中加入淀粉酶提取液1ml;最后各管混匀，放在40水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液1滴，并观察颜色变化情况。1.2.6测定小麦种子不同部位-淀粉酶的活力 准备三支试管分别编号、, 第一步在、管中加入淀粉酶提取液1ml; 第二步在、管中分别加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸1ml; 第三步在管中加入0.4mol/lNaOH溶液4ml，然后将各管放在40水浴中5min；第四步分别在、管中加入0.1%的预热的淀粉溶液2ml，将各管混匀，放在40水浴中进行酶促反应5min；最后在、管中加入0.4mol/lNaOH溶液各4ml（终止酶促反应）。再准备0、A、B、C四个管，第一步在A、B、C三个管中加入上面、管中的酶反应液2 ml，在0号管中加入蒸馏水2ml；第二步在0、A、B、C四个管中加入3、5二硝基水杨酸（DNS）2ml；第三步将各管混匀，放在沸水浴中5min，冷却，加蒸馏水定容至25ml；最后以0号管为空白对照，测定A、B、C三个管中溶液的吸光值（OD540），再查标准曲线，得到对应吸光值下的麦芽糖的量1。2 结果 2.1温度对小麦淀粉酶的影响4：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色；室温：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈浅蓝色；40：酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近无色；沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色；由此可以看出40是小麦淀粉酶的最适温度。2.2PH对小麦淀粉酶的影响PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色PH=5.6：淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈无色PH=9.6：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈浅蓝色由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH2.3激活剂，抑制剂对小麦淀粉酶的影响空白对照组：加入碘液后几乎呈无色加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色由此可以看出NaCl是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO4小麦淀粉酶的抑制剂2.4小麦种子不同部位-淀粉酶含量(1)小麦种子的芽：OD(0)= 0 OD(A)= OD(B)= OD(C)= 根据公式：-淀粉酶活性=（A-A）样品稀释总体积 样品重得小麦种子芽的-淀粉酶活性：34.36麦芽糖(mg)/Fw(g) 5min(2)小麦种子的麦粒：OD（0）=0 OD（A）= 0.150 OD（B）=0.665 OD（C）=0.680根据公式：-淀粉酶活性=（A-A）样品稀释总体积 样品重得小麦种体的-淀粉酶活性： 麦芽糖(mg)/Fw(g) 5min(3)小麦种子的根：OD（0）= 0 OD（A）= OD（B）= OD（C）= 根据公式：-淀粉酶活性=（A-A）样品稀释总体积 样品重得小麦种子根的-淀粉酶活性： 麦芽糖(mg)/Fw(g) 5min3 讨论1、 温度、环境PH值、激活剂、抑制剂是影响酶活性的几个重要因素，研究其中一个因素对酶活性的影响时，要控制其他因素不变（其他因素尽量控制在使酶活性最高的水平上），从而研究这一单一因素对酶活性的影响。2、通过对淀粉酶活性初步研究,说明温度、PH、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱;在一定PH范围内，酶的活性随PH的升高而升高，当达到某一PH（5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH时，酶的活性随PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增强Cu2+使酶活性减弱3。3、研究酶有重要的4、对于酶活力测定的方法有很多,比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法3,该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测-淀粉酶活性的方法,此法的实验条件容易控制,重复性好。组织印渍法在玉米种子吸水约5h后即可检测到-淀粉酶活性; 再如2-氯-4-硝基苯-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定-淀粉酶法,该法用新底物2氯4硝基苯半乳糖麦芽糖苷（GalG2CNP）直接测定淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（15s），线性范围宽（可达2200UL），试剂稳定性好，不使用KSCN、NaN3等激活剂，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，与EPS法对比相关良好6。参考文献1王林嵩生物化学实验技术M北京：科学出版社，2001，29322刘春