抗缺氧物质灌胃的小鼠的抗缺氧能力测定和Hsp70的表达.doc

抗缺氧物质灌胃的小鼠的抗缺氧能力测定和Hsp70的表达青海大学附属医院(810001) 王晓临河南师范大学科技部重点实验室(453000) 徐存栓四川大学华西医院肿瘤研究所教育部重点实验室(610041)王修杰广州美晨药业卫生部重点实验室(510075) 王冬杰中国科学院西北高原生物研究所(820001) 张宝琛摘要：目的：研究抗缺氧物质对小鼠的抗缺氧能力的影响，及Hsp70的表达。方法：小鼠100只，随机分为塞隆肌肉（高原鼢鼠）组、高海拔牦牛肉组、石榴籽组、红景天组和空白对照组，连续灌胃(ig) l 0天，于常压下进行抗缺氧实验和Western Blot测定Hsp70的表达。结果：红景天组、石榴籽组、塞隆肉组小鼠密闭缺氧存活时间延长；塞隆肉组、石榴籽组、 红景天组灌胃的小鼠的Hsp70表达被诱导出现。结论：抗缺氧物质(即红景天胶囊、石榴籽超临界萃取物、 塞隆肉超临界萃取物) 灌胃的小鼠密闭缺氧存活时间均延长；抗缺氧物质灌胃的小鼠的Hsp70的表达增强，说明抗缺氧药物可诱导Hsp70的表达，Hsp可以作为一种抗缺氧药物的研究和测试指标。关健词： 抗缺氧物质灌胃 抗缺氧能力测定Hsp70 热休克反应中图分类号: R282.71R364.4热休克反应是原核细胞还是真核细胞在所处环境的突然发生变化时表现出特殊的适应性的改变，如细胞代谢及基因表达的改变等，Welch et al1 经果蝇的幼虫在37.5孵化20min后发现了一些与热反应有关的蛋白，他们认为这些蛋白与热有关，故将之称为热休克蛋白（Heat shock protein,Hsp）,这种反应称之为热休克反应。理化和生物学因素可引起热休克反应如：炎症、辐射、发热、病毒感染、缺氧、缺血再灌注、重金属离子、乙醇等多种有害刺激均可诱导原核和真核细胞合成这类蛋白质,Hsp是一类高度保守蛋白 2，又被称作“分子伴侣” 3， Hsp分为若干个家族4,5，Hsp对于细胞在生长发育以及在各种病理生理条件下完整性的维持和功能的发挥都有着不可缺少的作用。药物刺激可引起的Hsp70的表达 6,7,8,9。Hsp在对抗缺氧、自由基损伤、缺血再灌注等因素引起的细胞氧化应激损伤中有着积极的保护 10。本文通过对抗缺氧物质灌胃的小鼠耐常压缺氧实验和Western Blot测定Hsp70的表达，验证了抗缺氧药物刺激可以诱导Hsp70表达出现，探索出Hsp可以作为一个指标（即药物是否具有抗缺氧作用）。材料和方法1 试剂主要化学药品及试剂:丙烯酰胺（acrylamide,Sigma公司）、双丙烯酰胺（bidsarylamide,Fluka公司）、，四甲基乙二胺（TEMED，Bio-Red公司）、明胶（gelatin,Sigma公司）、曲拉通X-100（TtitonX-100,Bebco公司）、十二烷基磺酸钠（SDS，Serva公司）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base,上海巴期生物公司）、标准分子量蛋白（Serva公司）、考马斯亮蓝R-250（Coomasie Brillant boue R250,Fluka公司进口分装）、雪山奶粉（青海省果洛洲奶粉厂）、鼠抗人Hsc70/Hsp70单抗隆抗体（StressGen,SPA-820,能与人、灵长目动物、啮齿动物和牛Hsc70/Hsp70的N端180按基酸残基区域特异结合）、碱性磷酸酶标记羊抗鼠lgL（北京中山公司）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT，Sigma公司）、吲哆基-磷酸二钠盐（BCIP，B.M公司）、硝酸纤维素膜（Gibco公司）、吐温20（Tween20，Sigma公司）、牛血清白蛋白（BSA，华美生的工程公司）、二氨基联苯胺（DAB，北京中山公司）、二乙基焦碳酸酯（DEPC，Sigma公司）。本实验所用的其他化学试剂均为分析纯。塞隆肌肉（高原鼢鼠-Myospalax baileyi）的超临界萃取由广州美晨药业完成，高海拔牦牛肉及石榴籽的超临界萃取由甘肃省轻工研究所完成。2动物分组及处理购入体重1 8g-22g昆明种小鼠(青海地方病研究所)100只，雌雄各半，饲养3天后,随机分为塞隆肌肉（高原鼢鼠）组、高海拔牦牛肉组、石榴籽组、阳性药物对照组和空白对照组，每组20只 , 正常进食饮水。将海拔5000m牦牛肉、塞隆肌肉、石榴籽的超临界萃取物以l 0浓度连续灌胃(ig)；阳性药物对照为红景天组，以青海三普药业红景天胶囊(批号:青卫药准字1999第000373号)配制成10溶液灌胃；空白对照组则给予等量的蒸馏水灌胃。每只小鼠每天灌胃剂量为002mlg体重，灌胃时间为l 0天，每天一次，实验前禁食12小时，最后一次给药l小时后开始实验。共100只小鼠用于常压下进行抗缺氧实验。3抗缺氧物质的灌胃小鼠耐常压缺氧实验：1密闭缺氧存活时间的测定参照保健食品管理法规汇编(1998) 11的方法，最后一次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250ml广口瓶内(每瓶内只放1只小鼠)，用凡士林涂抹瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，直至呼吸停止。以小鼠在密闭广口瓶内存活时间为指标，比较各组小鼠耐缺氧的时间。2 Western Blot测定Western Blot印迹（WB）按Towbin方法12进行,取材为缺氧实验后的心肌。立即置4缓冲液中匀浆, 12000g离心10min,取上清液, 测定匀浆液的蛋白质浓度, 分光光度计测量出蛋白质浓度和上样的总蛋白量，计算出上样体积后进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳,再行Western Blot。结果1抗缺氧物质灌胃的小鼠密闭缺氧存活时间(见表1)表1对小鼠密闭缺氧存活时间的影响（XS）组别动物只数剂量存活时间（m） 空白组20002mlg28.372.15牦牛肉组20002mlg30.381.97红景天组20002mlg38.03.1石榴籽组20002mlg37.52.8塞隆肉组20002mlg38.81.3注：与空白组P0.05；与牦牛肉组比较P0.05,灌胃红景天组，石榴籽组， 塞隆肉组小鼠密闭缺氧存活时间长。2. 抗缺氧物质灌胃的小鼠的Hsp70反应(见图1, 图2) 图1 1组 2组 3组 4组 5组注: 图1塞隆肉组(1组),石榴籽组, 红景天组(3组) Hsp70表达被诱导出现, 牦牛肉组(4组)及空白组(5组) Hsp70表达没有出现。灌胃的小鼠的Hsp70表达被诱导出现, 说明药物可以诱导Hsp70的表达。0 2 4 8 12 15 18 24 26 28 30 32 图2： -Actin(进样量50ug)注：图2可见，样品的进样量为50ug时效果较好。经过进样量筛选后，确定了检测小鼠心肌中Hsp的表达时进样量为50ug。讨论： 抗缺氧物质(即红景天胶囊，石榴籽超临界萃取物， 塞隆肉超临界萃取物)灌喂的小鼠密闭缺氧存活时间均延长, 抗缺氧物质的抗缺氧机理是:红景天的有效活性物质主要为红景天甙,即红景天提取物，红景天提取物动物常压耐缺氧能力有显著提高,抗缺氧能力的提高，主要是由于机体的细胞功能对缺氧环境的适应性改变,细胞氧的储备能力和对氧的利用能力增强,机体耐力和有氧能力随之提高,当出现供氧不足时，肌细胞的有氧能力降低，糖酵解得到动员，导致乳酸积累而产生疲劳。红景天能提高缺氧耐力和有氧能力，加速乳酸代谢，降低心肌耗氧量，改善心力储备13,17石榴籽超临界萃取物可显著提高小鼠抗缺氧的时间,提示其可改善机体的缺氧。石榴籽可显著改善脑微循环血流量18 ，作为天然植物，石榴籽资源丰富，但其改善微循环和抗缺氧的有效成份及机理需进一步研究和探讨。塞隆（高原鼢鼠）-对缺氧环境具有很强的适应性19，研究发现，塞隆血液当中红细胞数和血红蛋白都具有极显著差异20；塞隆心肌肌红蛋白含量为74167nmolg，骨骼肌肌红蛋白量为62727nmo1g都明显高于其它高原动物21；塞隆心肌、骨骼肌、肝脏和肾脏中乳酸脱氢酶活性明显低于其它高原动物22，说明塞隆在缺氧环境中通过代谢机制的调整，合成和积累了一些特殊的抗缺氧物质,如共轭亚油酸是其中之一。服用抗缺氧物质的小鼠的Hsp70的热休克反应证明，服用抗缺氧物质的小鼠的Hsp70的表达增强，测定出其抗缺氧的能力也增强，Hsp平时表达水平低，遇应激时迅速升高，Hsp可被药物所诱导（受转录和翻译两个水平调控），药物可以提高 Hsp表达，Hsp70的表达量与药物的刺激有关联，Hsp可以作为一个抗缺氧药物的研究和测试指标。参考文献1Welch WJMammalian guess response：ceil physiology，structurefunction of stress proteins，and implications for medicine end diseasePhysiol Rev，1992，72：1063-1081.2Leinonen M, Saikku P. 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