油菜花花色改良的研究进展.doc

油菜花花色改良方法的研究进展刘宏伟摘要：油菜作为我国非常重要的油料经济作物被广泛的种植，并且有作为绿色生物能源的巨大潜在价值。由于油菜的种植规模巨大在花季时使得它成为了非常重要的蜜源花，同时它构成的人工景观无疑促进了旅游观光业的发展，这种额外的附加价值在旅游业上升的趋势中越来越大，油菜花中提取的天然的色素可供食品添加之用而且更加绿色安全。然而油菜花花色单一因此限制了其经济附加值的增长。随着生物科学的发展使得这一设想成为可能，通过突变育种、转基因、细胞调控、植物整体生理水平调控等手段有可能实现。关键词：油菜花，花色，改良前言：油菜即油白菜（Brassica campestris L.）十字花科白菜变种，其本身即具有很大的价值，作为蔬菜含有丰富的维生素C、膳食纤维、低热量食品。作为油料作物，种子中含脂肪40%左右维生素A维生素D维生素E蛋白质氨基酸等。作为观赏植物，在某些非主产区其观赏价值已经超出农业生产的价值，此外还是重要的蜜源植物、油菜花还可以作为天然色素提取的原料。油菜花花色的改良主要是在原来的农业生产价值上增加附加值以提高观赏性，也可以增加色素种类含量。研究背景油菜种植面积十分广泛，花色单一为黄色遗传稳定性极强故而很少有机会在自然状态下取得其他花色的突变体用以推广育种故而若想取得其他颜色的变异体就不得不以人工干涉的方法去获得，尽管目前还没有人在这个方向从事研究但是生物科学，尤其是分子水平景观植物花色改良的很多的研究成果都为此提供了丰富理论基础总述植物的花色是由植物所能够合成的色素而决定的，植物的色素合成途径如下图所示。黄酮类物质是花色素中最常见的一种，所以，要培育出具有独特色泽的花卉，可用基因工程的方法对其黄酮类物质合成途径中的酶的基因进行操作。形成的花色素的种类取决于黄酮类物质代谢途径中的中问产物的不同化学结构。如果是花青素(sanidine)衍生物。则花色偏红，而若是翠雀紊(delphinidin)衍生物，则花色偏蓝。 在一系列转化试验中，人们将黄酮类物质生物合成途径中的一种或几种酶的基因的反义RNA转入矮牵牛，得到了各种花色独特、花样新颖的转基因矮牵牛。来源于玉米的编码二氢黄酮醇4还原酶(dihydroflavonol-4 reductase，DFR)的基因已被转入矮牵牛，并获得了新的开橙色花的品种。众所周知，黑郁金香是很珍贵的花卉品种，而蓝色的玫瑰、郁金香、康乃馨将更加珍贵。用基因工程的方法将有可能获得蓝色的花卉品种，但是蓝色色素的合成是由多种酶控制酶的，因此利用基因工程的方法培育蓝色花卉时就要综合考虑几方面的因素，因为翠雀素的合成需要有以下3个条件：第一，要有35羟化花色素苷(3，5一hydroxylated anthoyanin)的合成。第二，同时有黄酮醇辅色素的存在。第三，灌泡中相对较高的pH。人们已经从矮牵牛中克隆了3，5一类黄酮醇羟化酶基因和黄酮醇合成酶的基因这两个酶可以催化3，5一羟化花色素苷和黄酮醇辅色素的形成，从而保证了蓝色花朵所形成的第一和第二个条件。这项工作的难点在于如何获得合适的液泡pH。因为目前人们对植物是如何调节自身的液泡pH的还知之甚少。最近，人们终于从矮牵牛中分离出6个与pH有关的基因，即ph1- ph6，这6个基因可以控制矮牵牛花瓣细胞内的pH，从而影响花色。另外，人们还发现编码花色素苷台成途径中的一些调节因子的基因如anl、an2、an1l等突变后,突变株的细胞内,pH发生了改变。因此，人们推测上述3个基因与细胞内的pH调节有关，这些结果让人们有理由认为，利用转基因的方法培育出蓝色的观赏花卉是根有希望的。 利用基因工程的方法不仅能改变花的颜色还能改变花瓣颜色的深浅。将查尔酮合酶(chalcone synthaseCHS)基因转入单一颜色的矮牵牛、玫瑰、菊花中，使得转基因植物表现出深浅不同的花色。虽然具体的机制目前尚不清楚，但是总的来说转chs植物能够表现出不同的花色是由于共抑制(cosuppression)造成的。到目前为止，多数情况下人们还无法预知对花色进行修饰的结果，因为无从知道究竟该对哪些基因增加表达量，哪些基因减少表达量。随着对黄酮类物质合成途径了解的不断深入，人为控制花卉色彩终将会实现。1.花色形成的生理生化机理1. 1花色形成的影响因 花的颜色主要由三大类群色素决定: . 类黄酮(flavonoids) 色素, 这是一类积累在植物液泡中的次生代谢产物, 种类繁多. 参与花色形成的类黄酮主要有两类: 一类是产生红色或紫色的花色素苷; 另一类是黄色的2-苯甲川基苯并呋喃酮和苯基苯乙烯酮( 查尔酮) . 花色素苷所占的比例在很大程度上能改变花的最终颜色, 不同的花色素苷使花的颜色产生从红色到紫色的变化, 如花葵素产生橘红色, 花青素产生红色, 翠雀素产生紫色. . 类胡萝卜素( carotenoids) 色素, 它难溶于水, 以结晶或沉淀的形式存在于细胞质的质体中, 又称为质体色素, 包括有红、橙、黄色色素在内的一大色素类群. 存在于花瓣的多为B-胡萝卜素和堇菜黄质, 是玫瑰、郁金香、百合、紫罗兰等的黄色来源. . 与生物碱有关的其他水溶性色素. 如甜菜素、小檗碱、罂粟碱等. 由于它们在含花青素的植物中从未发现过, 因而引起研究者的极大兴趣.成色作用还受另一些因素的影响: 1) 共同成色作用, 某一色素会与其他色素或其他化合物起共同成色作用. 特别是类群色素, 都溶于水, 共同存在时会使花瓣各种过渡色彩. 某些花色素苷还能和有机酸如香豆酸发生酰化作用. 2) 螯合作用, 如果细胞液中存在Al3+, Fe3+, Mg2+, Mo2+等金属离子, 则色素常是螯合的. 特别是花青素苷, 合后在某种程度上改变了花色, 往往偏向紫色. 3) pH值, 液泡液pH值变化. 常引起花色改变, 其中花青素苷受pH值的影响最大, 酸性时呈红色, 中性时呈淡紫色, 碱性时呈蓝色.1. 2花色素苷生物合成的生化途径 利用颜色突变体进行遗传互作结合前体物饲喂试验, 即能了解花色素产生的生化途径. 花色素苷的生物合成一直是植物次生代谢领域的研究热点, 目前其合成途径及相关的酶已有很多研究报道.花色素苷合成的前体为丙二酰CoA和香豆酰CoA( p-coumatoyl-CoA) . 由查尔酮合酶( chalconesynathase, CHS) 催化二者形成黄色的查尔酮( chalcone) . 查尔酮异构化形成无色的黄烷酮(flavanone) . 此步骤可缓慢自发进行, 但在查尔酮-黄烷酮( chalcone-flavanone) 异构酶( CHI) 催化下可加速完成. 在黄烷酮羟基化酶( flavanone 3-hydroxylase, F3H) 的催化下, 黄烷酮在C3位置羟化形成无色的二羟黄酮醇( dihydroflavonol) . 进一步还原成无色花色素, 由二羟黄酮醇还原酶( dihydroflavonol 4-reductase, DFR) 催化完成. 无色花色素转变成有色的花色素( anthocyandin) , 然后糖基化形成花色素苷( anthocyanin) , 由UDP-葡萄糖类黄酮-3-氧-葡萄糖转移酶( UDP-glucoseflavonoid 3-oxy-glucosytransferase, UFGT) 催化完成2.基因工程改良花色的研究进展2. 1导入外源结构基因来改良花色 类黄酮生物合成途径中, CHS( 查尔酮合酶) 、CHI( 查尔酮异构酶) 、F3H( 黄烷酮-3-羟基化酶) 、F35H( 类黄酮-3, 5-羟基化酶) 、DFR( 二氢黄酮醇-4-还原酶) 、ANS( 花青素合成酶) 等参与色素代谢的酶类的结构基因均已被克隆。对于缺乏这些结构基因的花卉品种, 通过基因工程手段导入结构基因即可改变被修饰品种的类黄酮生物合成途径, 从而改变花色, 这方面已有很多成功的报道。第一次转基因技术运用于修饰花色的成功路线就是先从玉米中提取DFR基因, 再将它导入白色矮牵牛并使转基因植株自交, 使得二氢黄酮醇( 无色) 在DFR的作用下生成了花葵素糖苷( 砖红色) , 从而培育出了鲜橙色的矮牵牛新品种。2. 2利用反义RNA和共抑制技术来抑制CHS基因的活性, 造成CHS无色底物积累, 从而使花色变浅或无色 反义RNA技术就是将所研究基因的反义链结在一个启动子后面, 再用它去转化植物, 从而使被转化的植物表达靶基因的反义链并且抑制靶基因的活性。在表达CHS基因反义链的转基因植物里, CHS的mRNA和酶活性都有所降低, 从而造成了CHS无色底物的积累, 使花色变浅或成白色 2。北京大学生命科学学院陈章良等将来源于矮牵牛的查尔酮合酶正向克隆到含有CaMV35S启动子的中间介体中, 通过土壤农杆菌介导导入矮牵牛, 转基因矮牵牛花色获得明显变化。大致的技术路线是: 从矮牵牛花瓣中提取核糖核酸RNA, 反转录成cDNA后, 采用PCR得到查尔酮合酶基因。它是一个大约1. 2Kbp的基因。将这一基因克隆到可以进行植物转化的中间载体上, 再将这一中间载体转移给土壤农杆菌, 用转化后的土壤农杆菌侵染带有伤口的矮牵牛叶片。通过这一过程, 外源插入的查尔酮合酶就进入了矮牵牛染色体, 转化后的带有外源基因的细胞在无菌条件下培养长成愈伤组织, 进一步分化出根和芽, 成为转基因植物。结果发现, 作为转化受体的矮牵牛是单一的紫色, 而转基因植株的花朵有的变成了白色, 有的紫白相间, 而且紫白相间的方式也各不相同。在同一棵植株上还会开出紫、白、紫白相间的不同花朵 3。为何外源基因转入会使原来紫色的花朵变成白色或紫白相间的花朵呢?他们的解释是, 从分子生物学角度来看, 由于外源查尔酮合酶基因转入后与矮牵牛内源查尔酮合酶基因相互作用, 部分或完全抑制了这个基因的转录。这种现象称为共抑制, 其作用机理现在还没有确切的解释。2. 3通过导入与色素代谢过程有关的调节基因来调节生物合成基因活性、色素空间和时间积累和表达,从而调节花色 2. 3. 1转录水平上的调控花色素苷在花瓣发育过程中的合成主要通过合成酶量的增加来实现, 而这些合成酶量的增加则是由于这些酶基因转录的增加所致, 目前已经发现不少调控类黄酮生物合成途径酶的结构基因的调控基因。如玉米的R基因家族和金鱼草Del 家族; Myb类转录因子等等。把R和C1等这些在花色代谢途径中决定特殊路径的转录启动子导入拟南芥和烟草, 通过控制转录基因的表达来调节花色深浅, 通过调节基因使那些与花色素苷生物合成有关的结构基因在转录区域发生突变, 在转录水平上调节有关结构基因的活性从而调节花色深浅。通过CHS和DFR基因突变体在金鱼草中表达来修饰花色已经有成功报道。此外, 有些学者认为细胞色素CYTP450和CYTb5与不具体的NADPH: CYRP450还原酶之间的相互作用对于最大限度的生成35- 羟基化花色素苷是必要的 4。近来, 有报道说在矮牵牛中F35H的全部活动是由此及彼一个特殊的细胞色素b5控制的, CYTb5是有difF编码的, CYTb5被认为是能够促进一些细胞色素CYTP450在复原的膜泡上的活动。利用转基因植物进行酶之间的互补和竞争研究将有助于理解类黄酮生物合成途径及P450电子转运系统与F35H之间的相互关系 5。此外, 可以用核酶来抑制基因活性。核酶是具有酶活性的RNA分子, 能够特异性地切断mRNA, 从而阻止其编码蛋白的合成。因此, 该技术可以用来特异性地抑制类黄酮生物合成基因的表达, 从而改变花色。2. 3. 2非转录水平上的调控对色素合成基因在转录水平上的调控是主要的调控手段, 其它调节机理也是存在的。例如, 矮牵牛“红星”突变体, 其花在红色的背景上镶嵌了5个白色区域。研究表明, 白色区域的产生是由于该区域缺少CHS酶活性。但是在白色区域, CHS基因的转录是正常的, CHS酶活性的缺乏是因为CHS转录产物不能积累所致, 这说明, 在白色区域CHS基因表达的调控发生在转录以后。目前关于花色素苷的研究集中在对该合成途径中有关调节基因的鉴定和分析。玉米、矮牵牛、金鱼草中花色素苷生物合成途径中所涉及的酶及其相应的结构基因均已被成功鉴定并分离出来 6, 但是, 由于调节基因种类众多且彼此之间相互密切联系, 对有关调节基因的分离在现阶段技术上仍然不能达到, 因此困难重重, 对类黄酮生物合成途径中有关调节基因的研究不足已经成为限制花色改良的瓶颈。对这方面的研究有待加深。2. 4通过改变花瓣内表皮细胞的形状来改变花色研究表明, 花瓣内表皮细胞的形状将影响它们的视觉特性, 进而影响花色深浅。细胞越细长则光线斜射经过细胞形成的阴影越重, 整个花瓣的外在颜色就显得越深。野生型金鱼草的花瓣内表皮细胞是圆锥形, 因此, 呈现天鹅绒光泽, mixta突变体表现出的浅色调正是由于这些花瓣内表皮细胞形状呈扁平状的缘故。Mixta与编码Myb功能区域的蛋白质具有同源性, 这表明mixta蛋白质通过调节基因表达来控制细胞形状。在矮牵牛中shrivelledup( shp) 突变体引起一大块花瓣表皮细胞形状呈现“轮胎”形, 从而导致花色发生显著变化。然而, mixta和shp的下游靶基因都还未被确定, 因此, 控制花瓣表皮细胞形状变化的分子机理仍需研究。3. 细胞杂交在改良花色上的应用的设想 自从1972年Carlson首次获得粉蓝烟草与郎氏烟草的体细胞杂种以来，体细胞杂交已在许多植物的种内、种问、属间甚至科问成功实现。近年来，随着体细胞杂交技术的不断发展和完善，研究热点已由模式植物向经济作物和禾谷类作物转移，对原生质体融合的亲本组合已有针对性地选择和扩展，诱导融合和检测细胞杂种的技术也在不断改进，有些植物的操作系统已经优化甚至程序化。可以预测，体细胞杂交与常规育种程序的结合，将会在作物遗传改良和新品种选育方面发挥巨大的作用。体细胞杂交的意义主要表现在以下几个方面： 第一，实现远缘杂交，形成新的物种。体细胞杂交能克服常规有性远缘杂交时存在的生殖隔离和杂交不亲和性的障碍，为广泛重组遗传物质、形成新的物种开辟了新途径。例如，马铃薯和番茄通过体细胞融合达到了至今有性杂交未能获得的属间杂种薯番茄和番茄薯，用甘蓝与白菜的体细胞融合获得了甘蓝型欧洲油菜，重现了自然界的进化过程。此外，目前已成功地在多种禾本科植物进行了远缘种间和属问体细胞杂交，获得了多种再生植株；木本植物的原生质体融合也取得显著成果，尤其是在柑橘类获得种间、属间杂种。 第二，创造细胞质杂种。农作物的许多性状如细胞质雄性不育、除草剂抗性等是由细胞质控制，常规的有性杂交只能将雄性配子的核传递给子代，而体细胞杂交融合了双亲的细胞质，可使细胞质基因如线粒体基因、叶绿体基因等重组，将双亲的细胞质传递给子代，即可产生细胞质杂种。目前已建立起配制细胞质杂种的供体一受体实验体系，在油菜、胡萝b、烟草、马铃薯、水稻和番茄等植物上已获得成功，并成为当前体细胞细胞工程杂交研究的一个热门领域。第三，培育作物新种质和新品种。通过近缘种内或种问的体细胞杂交可获得稳定的具有双亲两套染色体的体细胞杂种植株。它们往往可育，并能作为育种的新材料通过常规育种获得新品种。通过体细胞杂交技术可以向栽培种转移野生种所具有的