两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活.doc

检测纤维素酶酶活力滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素 能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50，恒温lh)下， 以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。3、滤纸酶活力(FPA)的测定：1 取05ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；2 再加入500.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；3 加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；4 同时用100煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；5 根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位UmL。W： 为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。N： 为酶液稀释总倍数。T： 为反应时间。M： 为样品的体积。4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。5、3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。纤维素酶活力的测定CMC糖化力法1、 定义：1毫升液体酶（或1克固体酶粉），在40 pH4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。2、 原理：CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，吸光度与酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表内切-1.4-葡聚糖的活力。3、 试剂：3.1 0.1mol/LpH4.6醋酸醋酸钠缓冲溶液：将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。注意：0.2molL醋酸钠溶液：称取27.22g结晶乙酸钠（AR）定容至1000ml。 0.2molL醋酸溶液：称取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。3.2 3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。3.3 葡萄糖标准溶液（1.0mg /ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。3.4 羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液100 ml,混匀后存于冰箱内备用。配后隔天使用。4、 分析步骤：4.1标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。4.2 待测酶液制备：准确称取酶粉1.0克置研钵中，加入pH4.6的醋酸缓冲溶液少量溶解，研细，将上清液小心倾入25ml刻度试管中，沉渣再加入少量缓冲液,如此捣研3-4次，最后全部移入试管中并定容至25ml，摇匀，过滤，滤液待测。4.3 测定：取1.5mlCMC-Na溶液与0.5ml适当稀释的酶液于25ml试管中，40水浴保温30min后立即加1.5mlDNS显色剂，沸水浴煮沸5min，取出立即冷却，用水定容25ml，在540nm测吸光度As。空白样：先加1.5mlDNS试剂，后加0.5ml待测酶液，与1.5mlCMC-Na溶液，于25ml试管中，沸水浴煮沸5min，冷却后用水定容25ml，在540nm测吸光度Ac