VIDAS 大肠杆菌O157 (ECO)筛选.doc

VIDAS 大肠杆菌O157 (ECO)筛选文章出处：长源科技 发布时间：2005-08-07仅用于实验室应用范围VIDAS大肠杆菌O157 (ECO)分析，采用Vitek免疫诊断分析系统（VIDAS）作为自动定性酶联荧光免疫分析(ELFA)，对食品中的大肠杆菌血清型O157进行检测。前言大肠杆菌0157时公认的出血性肠炎的病原菌，在美国、加拿大、英国、日本以及比利时造成数起爆发感染4，8。除牛奶、苹果汁及肉产品可引起感染外，最常见的感染源还是牛肉。肠痉挛和血性腹泻是0157：H7感染后的典型症状。约10%的病人发展成急性肾衰（血尿综合征）。易感人群多为5岁以下小孩及老人（8）。VIDAS ECO分析为一种对大肠杆菌0157快速筛选方法，能够保证对有动力和无动力的菌株进行检测。最新研究表明致病性大肠杆菌0157血清型可能有无动力菌株(3)。检测原理VIDAS大肠杆菌O157 (ECO)分析，是一种在自动VIDAS仪器上进行的酶联荧光免疫分析（ELFA）方法。固相容器（SPR）是一个类似于加样头的一次性使用装置，在检测中起固相及加样器之用。SPR用抗大肠杆菌O157抗体包被。各种试剂均封闭在试剂条内。所有检测步骤均自动由VIDAS仪器完成。煮沸过的增菌肉汤加入试条孔后，在特定时间内，样本在SPR内、外反复循环。样本中的O157抗原与包被在SPR内部的O157抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体也在SPR内、外循环并与固定在SPR壁上的大肠杆菌0157抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。SPR中所用荧光底物为磷酸4-甲基伞型物。仍结合在SPR壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物：4-甲基伞形酮。在VIDAS中由光扫描器在450nm处检测该荧光强度，试验完成后由计算机自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样本的实验报告。VIDAS大肠杆菌O157试剂盒组成（30个人份/每盒）30个ECO试剂条参考下表30个ECO SPRECO SPR的内面制造时已用抗大肠杆菌O157多克隆抗体包被。1瓶标准液(3ml) S1纯化，灭活的大肠杆菌O157抗原，含1g/l叠氮钠和蛋白稳定剂。一瓶阳性对照(6ml) C1纯化，灭活的大肠杆菌O157抗原，含1g/l叠氮钠和蛋白稳定剂，瓶签上有对照范围。一瓶阴性对照(6ml) C2TRIS-NaCl-Tween(150mmol/l),含1g/l叠氮钠MLE 卡包含校正测试所需的工厂校正数据。说明SPRSRP在生产时以抗大肠杆菌0157多克隆抗体包被。每一SPR上均标有“ECO”。从包装袋中取出SPR后要及时封闭包装袋。试剂条包含10个以箔封的孔，并覆以标签，标签上有条形码，显示测试种类，试剂盒批号、有效期等。第一孔加入样本，最后一孔是荧光测定用比色杯。中间各孔含有实验用各种试剂。 大肠杆菌O157试剂条说明孔试剂1样本孔：此孔加0.5ml煮沸过的增菌肉汤。2前洗涤液（0.4ml）: TRIS-NaCl(150mmol/l)Tween pH7.6+1g/l叠氮钠。3 - 4 - 5 - 7- 8 - 9洗涤液（0.6ml）: TRIS-NaCl(150mmol/l)Tween pH7.6+1g/l叠氮钠。6酶标记物（0.4ml）:用碱性磷酸酶标记多克隆抗体（羊），含1g/l叠氮钠。10含底物（0.3ml）的比色杯：磷酸4-甲基伞形物(0.6mmol/l)+ 二乙醇胺（DEA）(0.62mol/l或6.6%,pH9.2)+1g/l叠氮钠。实验名称、批号和校正参数均在MLE卡上标明并作成仪器可读的条形码。未提供但应具备的设备- 加样器：最小加样量为0.5ml。- 水浴箱（100）或相当装置。注意事项 试剂盒的所有试剂均为潜在生物危险材料。因此，通过可接受的方法来处理所有使用过 的试剂和其它污染材料。 请勿使用超出有效期的试剂。 不同批号试剂请勿混合使用。 试剂中含1g/l叠氮钠，该物质可与铅或铜管道反应形成爆炸性金属叠氮物。如果含叠氮钠的液体在这样的管道系统中处理，要用大量的水冲洗以避免形成金属叠氮物。 常规清洁和清洗VIDAS仪器，参阅VIDAS操作手册有关步骤。保存- VIDAS ECO试剂盒存于2-8。- 勿冷冻试剂。- 使用后余下的试剂放回2-8。- 打开试剂盒后，SPR包装袋应密封完好，无破损，否则请不要使用SPR。- 取出密封袋内所需SPR，其余SPR应封好包装，并放回2-8，有利于试剂的稳定；- 如果保存得好，所有试剂在有效期内稳定性不变。勿用超过失效期的试剂。标本制备我们推荐下面的方法：将增菌肉汤预温至41。以无菌方法向消化袋中加入25g（25ml）各类食品。日常食品：以无菌方法向225ml含以无菌方法向225ml含吖啶黄的m-TSB中加入25g样品。其它食品：以无菌方法向225ml含新生霉素的m-TSB中加入25g样品。在411。消化与孵育6-7小时。取1ml预增菌肉汤接种于9ml含头孢克肟和亚碲酸钾的麦康凯肉汤（CT-MAC,见培养基制备附录）。在35-37孵育181小时。孵育之后，取1ml增菌肉汤加入试管中，在100 水浴中加热15分钟。剩余增菌肉汤存于2-8，以备对阳性检测结果确认。输入MLE卡信息每一个新试剂盒在使用之前，首先要使用试剂盒中的MLE卡向仪器（VIDAS 或mini-VIDAS）输入试剂规格（或出厂的校正曲线数据），否则方法将无法运行。每一盒试剂只需输入一次。可以使用MLE卡自动输入或手动输入。自动输入MLE卡信息时，卡正面向上放入塑料托盘，再将托盘箭头朝上放入仪器色测试仓，选“Calibration”菜单“Read master lot” 选定放卡的测试仓。几分钟后仪器完成MLE卡的信息读入。人工输入MLE看信息时，选“Manual Entry”菜单，再键入卡下方的字母和数字。输入后按确认。仪器会打印出输入的数据，请将其与MLE卡的数据对比。若不一致，再重新输入。输入失败时，屏幕会提示出错信息。详细的使用方法见VIDAS或mini-VIDAS操作手册。校正每一个新试剂盒在输入MLE卡信息之后，需使用试剂盒内的校正液进行校正，以后每14天进行一次校正。此项操作可以提供仪器特定的校正曲线，对于在保存期限内可能出现的小的分析信号偏移可以进行补偿。校正液S1在同一次测试中必须做双份（详见VIDAS操作手册）。校正值必须在设定的RFV(相对荧光值)值之内，否则，需重新校操作步骤1. 冰箱中取出VIDAS ECO试剂盒并使其恢复到室温（最少30分钟）。从试剂盒中取出所需试剂，并将未用的试剂放回2-8贮存。用封口条将SPR贮存袋重新封好。2. 在ECO试剂条的空白处，标上样本号。3. 输入所需的信息以便建立work list.键入“ECO”至检测编号，再输入将要检测的实验号。标准必须在work list 的首位并作双份，随后是C1和C2（见操作手册）。4. 分别吸取500l标准，对照和煮沸的样本（冷却后）加入试剂条样本孔中央。在VIDAS测试前必须将营养肉汤在100加热15分钟。5. 依屏幕所示，将SPR和试剂条放入VIDAS相应的位置。核对位置以确保SPR上3个字母编码的颜色标记与试剂条相符。6. 根据VIDAS操作手册开始检测步骤。所有分析过程均由仪器自动完成。检测约需45分钟。7. 所有用过的SPRs和试条丢弃于适当的容器。 质量控制试剂盒附有阳性和阴性对照。每批新的试剂盒均应用阴性和阳性对照进行检测，以证明运输和贮存过程未影响其性能。根据自己实验室的常规程序检测对照品。提供的对照品可直接使用，但用前需充分混合再加入试剂条的样品孔。阳性对照数值应在瓶签所示范围之内。如所测数值超过此范围，样本结果不能报告。注意：如果标准超过范围，检测值可根据另一个标准重新计算。详见VIDAS操作手册结果检测完成后，结果由计算机自动分析。每份样品有两个荧光读数，第一个数值表示SPR未加入底物时，容器和底物的本底。第二个读数表示SPR内面的酶复合物与底物反应后的结果，该数值减去本底后则为相对荧光值（RFV）。检测值则是由每份样本的RVF与标准对照值相比得出的。检测值=样品RFV/标准RFV阈值和结果解释实验结果阈值解释小于 0.10阴性大于等于0.10阳性打印报告内容包括试验类型、样本号、日期和时间、试剂盒批号及有效期、每个样品的RFV、检测值和相应结果。检测值低于阈值下限表明不能检出样本中含有大肠杆菌O157：H7抗原。若大于（或等于）阈值上限则为阳性结果。阳性结果必须用标准培养方法对保存于2-8的增菌肉汤分离鉴定确认。本底数值超过预测的分界值（提示有少量底物污染）时，结果无效。对此可用原始样本重新检测。如果检测样本的试剂条没有标准，结果亦为无效。对此，可用相同批号的试剂条做双份标准，结果可根据新存储的标准重新计算。详见VIDAS操作手册。阳性结果的确认将储存于2-8的CT-MAC肉汤： 在胰胨盐（货号42020）中作连续10倍稀释，取100ml 10-2、10-3和10-4的稀释液置于SMAC 和CT-SMAC平板（见附录所述），在35-37孵育18-24小时。 或使用VIDAS ICE 测试（货号30526），按使用说明在VIDAS仪器上进行免疫浓缩。在CT-MAC和SMAC平板上，大肠杆菌O157：H7株（山梨醇阴性）呈现中心黑色的无色菌落，需对其进行生化和血清学鉴定。可疑菌落的确证方法向见附录。山梨醇阳性的菌落在此平板上呈现粉红或红色。注意1. 不同试剂盒的试剂不要混合使用。2. 使用前所有试剂在室温至少放置30分钟。3. 试验前旋转混匀标准液、对照液及煮沸的样本以确保结果的重现性。测试标准时准确吸取500ml标准液，以确保结果可靠。4. 样本处理或保存不当可导致错误结果。注：在进行ECO检测前样本必须在100煮沸15分钟。测试效果VIDAS ECO 可检测有动力与无动力的大肠杆菌0157。沙门氏菌N群和部分枸橼酸杆菌可出现交叉凝集。附录：培养基改良胰酶大豆汤（mTSB）规格：1升脱水胰酶大豆汤 30.0g胆盐3号 1.5g无水Na2HPO4 1.25g酪蛋白水解物 10.0g 加1000ml蒸馏水，121高压灭菌15分钟。对于日常食品，冷至室温，加2ml过滤除菌的盐酸吖啶黄酸水溶液，使终浓度为100g/ml；对于其它食品，加入1ml过滤除菌的新生霉素（20mg/ml），使终浓度为20mg/l。含头孢克肟和亚碲酸钾的麦康凯肉汤（CT-MAC）按操作手册制备麦康凯肉汤（货号51015）。121高压灭菌15分钟。每升肉汤中加入2.5mg亚碲酸钾(即250ml 1%的盐酸溶液，货号55501)和50mg过滤除菌的头孢克肟（即1ml 50mg/l的储备液）。为避免非特异性干扰，建议使用专用的生物梅里埃麦康凯肉汤（货号51015）。含头孢克肟和亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）按操作手册制备山梨醇麦康凯琼脂（SMAC）。121高压灭菌15分钟。冷至45-50，每升融化的琼脂中加入2.5mg亚碲酸钾(即250ml 1%的盐酸溶液，货号55501)和50mg过滤除菌的头孢克肟（即1ml 50mg/l的储备液）。制备50mg/l的头孢克肟储备液在100ml 100mmol/l的碳酸氢钠溶液（pH8.0）中溶解5mg Cefixim，过滤除菌并储存于 2-8。参考文献1. 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