质粒抽提的8大窍门.doc

质粒抽提的8大窍门时间：2010-02-04 09:42:01 来源： 作者： 点击： 480次 1、摇菌时间 过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。 2、起始菌体量 大家习惯说“从多少 ml 菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。 3、菌体的彻底悬浮 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。 4、使用相对过量的试剂 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一点菌体。 5、裂解时间 加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。 6、中和的操作 在1.5ml离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。 7、中和后的离心去蛋白 一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。 【降低 RNA 残留的方法】 RNA的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase。 【降低 gDNA 残留的方法】 gDNA的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断 gDNA。裂解体系越粘稠，gDNA 越容易被扯断；操作手法越重，gDNA 也越容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低 gDNA 残留的最好方法。 【降低蛋白质残留的方法】 蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。 【降低质粒 Nick 的方法】 细菌收获时间，菌株的选择，抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。细菌收获过早，质粒还在复制过程中，Nick 的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作，也可以导致一些 Nick，但影响不会比前两者大。 【降低变性超螺旋的方法】 理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。) 【关于质粒多聚体】 QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19)，电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二，这种“粘”只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种“粘”是脆弱的，线性后的刚性足以打破它。如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可以不管它(也管不了)，因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不会影响太大。总之，碰到这种情况，不要简单地认为有问题，而是