三七总皂苷促进脑出血后侧脑室室管膜下神经干细胞的增殖和分化__.doc

司银楚，等. 三七总皂苷促进脑出血后侧脑室室管膜下神经干细胞的增殖和分化基础医学三七总皂苷促进脑出血后侧脑室室管膜下神经干细胞的增殖和分化*司银楚，李巾伟，张丽娟，吴海霞，许 红，朱培纯Panax notoginseng saponins promote the proliferation and differentiation of neural stem cells in subependymal zone of the lateral ventricle in rat brain after intracerebral hemorrhage Si Yin-chu, Li Jin-wei, Zhang Li-juan, Wu Hai-xia, Xu Hong, Zhu Pei-chunDepartment of Anatomy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, ChinaSi Yin-chu, Doctor, Associate professor, Department of Anatomy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, CSupported by: the National Natural Science Foundation for Youth of China, No. 30000222; the Key Program of Ministry of Education of China, No. 104036*Received:2007-06-26Accepted:2007-11-12北京中医药大学解剖学教研室，北京市 100029司银楚，男，1968年生，湖南省桑植县人，土家族，1999年北京中医药大学毕业，博士，副教授，主要从事中医药防治脑病机理的基础研究。国家自然科学基金青年课题（30000222）*；教育部重点研究课题（104036）*中图分类号: R743文献标识码: A文章编号: 1673-8225(2008)08-01414-04收稿日期: 2007-06-26修回日期：2007-11-12(07-50-9-4854/GWQ)AbstractAIM: Panax notoginseng saponins can promote the expression of Nestin, proliferating cell nuclear antigen and basic fibroblast growth factor in subependymal zone of lateral ventricle in rat brain after cerebral hemorrhage, and accelerate the proliferation and differentiation of cortex neural stem cells of fetal rats. This article investigates the influence of panax notoginseng saponins on proliferation and differentiation of subependymal cells of lateral ventricle in rat brain after intracerebral hemorrhage by the collagenase method and immunohistochemical staining. METHODS: Experiments were performed at the Laboratory of Neuro-anatomy of Beijing University of Chinese Medicine from 2002 to 2006. Sixty clean male Wistar rats weighting 220-250 g were provided by Animal Experimental Center of China Academy of Chinese Medical Sciences. Rats were randomly assigned into a normal group, a model group and an administration group, 20 in each group. Animal intervention met the animal ethical standard. Panax notoginseny saponins Xueshuantong injection was offered by Inner Mongolia Kangyuan Yaoye Company, No. 22-5802 (1999) 1787, specification 5 mL: 175 mg. Rat models of cerebral hemorrhage were established with collagenase as a inductor. Rats in the administration group received 35 mg of panax notoginseny saponins intraperitoneally after the surgery, once a day. Rats in the model group received saline intraperitoneally after the surgery, once a day. Rats in the normal group did not receive any intervention. Proliferating cell nuclear antigen, - tubulin and glial fibrillary acidic protein expression in ependyma was determined by the immunohistochemical staining and image analysis. RESULTS: Sixty rats were involved in the result analysis. Proliferating cell nuclear antigen, - tubulin and glial fibrillary acidic protein expression were found in subependymal zone of medial wall, lateral wall and the angle of lateral-dorsal of lateral ventricle in rat brain after cerebral hemorrhage in the model group. The numbers of proliferating cell nuclear antigen, - tubulin and glial fibrillary acidic protein expression could increase greatly by panax notoginseng saponin, and their positive responses were reinforced as compared with the model group （P 0.05， P 0.01）. CONCLUSION: Panax notoginseng saponins can promote the proliferation, differentiation and migration to the focus of infection of neural stem cells in subependymal zone of lateral ventricle in rat brain after intracerebral hemorrhage, and it can repair the injured brain tissue.Si YC, Li JW, Zhang LJ, Wu HX, Xu H, Zhu PC.Panax notoginseng saponins promote the proliferation and differentiation of neural stem cells in subependymal zone of the lateral ventricle in rat brain after intracerebral hemorrhage.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(8):1414-1417(China)/zglckf/ejournal/upfiles/08-8/8k-1414(ps).pdf摘要目的：三七总皂苷可促进去大脑皮质血管后成年大鼠前脑侧脑室室管膜下层神经干细胞Nestin、PCNA和bFGF的表达，以及促进离体胎鼠皮质神经干细胞增殖、分化作用。实验拟采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型和免疫组织化学染色法观察三七总皂甙对脑出血大鼠侧脑室室管膜下神经干细胞增殖和分化的作用。方法：实验于2002/2006年在北京中医药大学神经解剖学实验室完成。实验材料：Wistar大鼠60只，雄性，清洁级，体质量220250 g，由中国中医研究院实验动物中心提供，将大鼠随机分为正常组、模型组和给药组，20只/组，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。三七总皂苷血栓通注射液由内蒙古康源药业提供，批准文号:22-5802-内卫药准字(1999) 1787号，规格:5 mL:175 mg。实验方法：采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型，给药组术后腹腔内注射三七总皂苷35 mg，1次/d，模型组术后腹腔注射生理盐水，1次/d，正常组不作任何处理。实验评估：采用免疫组织化学染色法和图像分析技术检测增殖细胞核抗原（PCNA）、型微管蛋白（Tuj-1）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）在室管膜下的表达。结果：60只大鼠均进入结果分析。脑出血后模型组同侧侧脑室内、外侧壁及背外侧角室管膜下区有增殖细胞核抗原、型微管蛋白、胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞，给予三七总皂苷干预后，室管膜下细胞增殖细胞核抗原、胶质原纤维酸性蛋白、型微管蛋白阳性细胞数目和反应强度较模型组明显增强，差异具有显著性意义（P 0.05， P 本文导读课题背景：课题为国家自然基金青年课题和教育部重点研究课题的资助。三七总皂苷可促进去大脑皮层血管后成年大鼠前脑侧脑室室管膜下层细胞Nestin、PCNA和bFGF的表达，以及促进离体胎鼠皮层神经干细胞增殖、分化作用。实验拟采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型（ICH）和免疫组织化学染色法观察三七总皂甙对脑出血大鼠侧脑室室管膜下神经干细胞增殖和分化的作用。同行评价：神经干细胞具有分化成神经元的潜能，在神经损伤修复过程中可能起重要作用。文章采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型和免疫组织化学染色法观察脑出血后损伤侧前脑侧脑室外侧壁侧脑室室管膜下的PCNA、GFAP、Tuj-1阳性细胞表达及研究中药成分三七总皂苷对脑出血大鼠侧脑室室管膜下神经干细胞增殖和分化的作用，内容新颖，有一定的学术创新和临床实用意义。创新要点：实验采用脑出血大鼠模型和免疫组织化学技术，从形态学角度肯定了成年大鼠侧脑室室管膜下细胞是神经干细胞，脑损伤（脑缺血、脑出血）能促进室管膜下细胞的增殖和分化；同时肯定了三七总皂甙具有促进成年大鼠脑内室管膜下细胞增殖和分化的作用。ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 14150 引言三七总皂苷是中药三七的有效部位，具有促进脑出血大鼠脑出血病灶及病灶周围bcl-2 mRNA的转录与bcl-2蛋白的表达1，抑制脑出血大鼠脑出血灶及病灶周围caspase3 mRNA的转录及caspase3 p20蛋白的裂解活化，减少细胞凋亡，促进脑出血后前脑内神经元的存活及损伤修复的作用2。三七总皂苷能够抑制脑出血大鼠脑出血灶及病灶周围NMDA受体中的NR2A及NR2B的表达，降低NMDA受体可介导Glu神经兴奋毒性作用，挽救受损神经元的作用3。成年哺乳动物侧脑室室管膜下区(the subventricular zone，SVZ)是神经干细胞的源地4-17。1 材料和方法设计：对照观察实验。单位：北京中医药大学。材料：实验于2002/2006年在北京中医药大学神经解剖学实验室完成。Wistar大鼠60只，雄性，体质量220250g，中国中医研究院实验动物中心提供，随机分为正常组（20只）、模型组（20只）和给药组（20只），实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。药品与试剂：三七总皂苷(血栓通注射液):内蒙古康源药业，批准文号:22-5802-内卫药准字(1999) 1787号，规格:5 mL:175 mg。设计、实施、评估者：实验的设计、实施及评估由全体作者完成，均经过培训。方法：模型的制备8：大鼠用10%水合氯醛 (400 mg/kg)麻醉，固定于SN-2型脑立体定位仪上，参照文后文献1方法，切开头部正中皮肤，暴露颅骨，以前囟为零点，横坐标向右4 mm，纵坐标向后1 mm，颅骨钻孔，直径1 mm，以微量进样器取0.5 L type 型胶原酶，垂直向下进针 5 mm缓慢注射，于5 min内注完，缝合切口。给药组术后腹腔注射三七总皂苷35 mg，1次/d；模型组术后腹腔注射生理盐水 1 mL，1次/d；正常组不作处理。冰冻切片和免疫组织化学：各组大鼠分别于造模/给药1, 3, 7 d用10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛左心室升主动脉灌注固定，取前脑，4 4%多聚甲醛后固定46 h，放入4 20%蔗糖溶液保存。连续冰冻切片，片厚25 m。免疫组织化学技术采用ABC法，主要步骤如下：1%甲醇双氧水室温30 min；蛋白酶k消化37 30 min；加入正常羊血清37 30 min；加入兔抗PCNA(1100)、GFAP（1800）、Tuj-1（12 000）4 过夜；加入生物素化羊抗兔IgG/Bio工作液，37 孵育 2 h；加入S-A/HRP工作液37 孵育2 h；0.05% DAB 37 孵育30 min； H2O2与0.05%DAB显色，脱水封固。上述所用稀释液均为pH 7.4的0.01 mol/L PBS。阴性对照片省去一抗，用0.01 mol/L PBS代替图像分析：从各组连续切片中选取10张前部侧脑室切片，每张切片于侧脑室外侧壁SVZ，用CMIAS8真彩色病理图像分析系统进行PCNA、GFAP、Tuj-1阳性细胞计数。主要观察指标：增殖细胞核抗原（PCNA）、型微管蛋白（Tuj-1）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）在室管膜下的表达。统计学方法：统计学处理由第二作者完成，所有数据以s表示，计数资料组间比较用t检验，数据处理采用SPSS 7.0软件。2 结果 2.1 实验动物数量分析 60只大鼠均进入结果分析。2.2 三七总皂苷对脑出血大鼠侧脑室SVZ 区PCNA表达的影响 见图1，2。正常大鼠前部侧脑室外侧壁SVZ可见少量细胞胞核PCNA阳性表达，阳性胞核呈棕色或深棕色，部分胞核呈分裂状。脑出血后1 d出血灶同侧侧脑室SVZ细胞PCNA阳性反应数目增高，3 d后阳性表达明显上调，7 d时仍有持续阳性表达。给药组PCNA阳性细胞个数增多，着色加深，核分裂增加。阳性胞核呈深棕色，形态多样，大小不等，多呈圆形、椭圆形、双凸杆状，有很多细胞核呈分裂相，可见一些膨大的阳性胞核。侧脑室背外侧角SVZ有大量PCNA阳性胞核，沿着胼胝体下方呈流样趋向病灶周围。外侧壁SVZ下部也可见到PCNA阳性细胞核向病灶周围的流状分布趋势。对正常组、模型组和给药组大鼠侧脑室外侧壁PCNA阳性细胞进行计数，结果见表1。Figure 1 Positive expression of proliferating cell nuclear antigen in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain at day 3 after intracerebral hemorrhage in the model group （120） 图1 模型组3 d侧脑室外侧壁SVZ区PCNA阳性表达（120）Figure 2 Positive expression of proliferating cell nuclear antigen in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain at day 3 after intracerebral hemorrhage in the administration group（120） 图2 给药组3 d侧脑室外侧壁SVZ 区PCNA阳性表达（120） 表1 脑出血大鼠侧脑室外侧壁PCNA阳性细胞的数目比较Table 1 The number of proliferating cell nuclear antigen positive cells in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain after intracerebral hemorrhage （s，n =10）GroupNormalModelTreatment 16.473.01 90.75023.297b119.41721.748d 15.542.84 92.08317.637b122.16718.907c1 d 3 d 7 d 15.232.3448.00010.846a59.67711.372caP 0.05, bP 0.01， vs. normal group, cP 0.05, dP 0.01, vs. model group2.3 三七总皂苷对脑出血大鼠侧脑室SVZ 区GFAP表达的影响 见图3，4。正常大鼠前脑侧脑室外侧壁和背外侧角室管膜及SVZ可见少量阳性细胞。GFAP阳性细胞胞浆和纤维呈黄色或淡黄色，阳性细胞数量少，胞体很小，纤维纤细，分布稀疏。脑出血后1 d,损伤同侧侧脑室外侧壁及背外侧角SVZ区 GFAP阳性细胞的增多。3 d时阳性表达增强更加明显，尤其在背外侧角的表达，7 d持续表达。GFAP阳性细胞沿胼胝体呈带状表达，同时可见向病灶周围方向的流样表达。给药组大鼠侧脑室外侧壁SVZ 区GFAP阳性细胞及纤维紧密排列，阳性细胞胞体增大，突起增粗变长，呈树枝状或不规则形，向病灶周围的流样表达明显增强。正常组、模型组和给药组大鼠侧脑室外侧壁GFAP阳性细胞计数差异显著（P 0.05， P 0.01），见表2。Figure 3 Positive expression of glial fibrillary acidic protein in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain at day 3 after intracerebral hemorrhage in the model group （150） 图3 模型组3 d侧脑室外侧壁SVZ区 GFAP阳性表达（150）Figure 4 Positive expression of glial fibrillary acidic protein in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain at day 3 after intracerebral hemorrhage in the administration group （150） 图4 给药组3 d侧脑室外侧壁SVZ 区GFAP阳性表达（150） 表2 脑出血大鼠侧脑室外侧壁GFAP阳性细胞的数目比较Table 2 The number of glial fibrillary acidic protein positive cells in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain after intracerebral hemorrhage （s，n =10）GroupNormalModelTreatment 19.8206.240 84.91711.611b101.00011.955d18.5304.19088.41716.300b98.16721.946c1 d 3 d 7 d17.4605.18036.5838.898a59.75017.623daP 0.05, bP 0.01， vs. normal group, cP 0.05, dP 0.01, vs. model group2.4 三七总皂苷对脑出血大鼠侧脑室SVZ区 Tuj-1表达的影响 见图5，6。正常大鼠侧脑室svz的Tuj-1阳性细胞极少，呈弱阳性表达。脑出血1 d大鼠侧脑室SVZ区Tuj-1表达增高，3 d时大鼠侧脑室外侧壁上壁SVZ区Tuj-1阳性细胞明显增加，Tuj-1表达在胞浆内，并伸向突起。脑出血7 d Tuj-1持续表达。给药组大鼠侧脑室外侧壁Tuj-1表达与模型组比较明显增强，阳性细胞数目明显增加。见表3。Figure 5 Positive expression of - tubulin in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain at day 3 after intracerebral hemorrhage in the model group（150） 图5 模型组3 d侧脑室外侧壁SVZ区 Tuj-1阳 性表达（150）Figure 6 Positive expression of - tubulin in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain at day 3 after intracerebral hemorrhage in the administration group （150） 图6 给药组3 d侧脑室外侧壁SVZ 区Tuj-1阳性表达（150） 表3 脑出血大鼠侧脑室外侧壁Tuj-1阳性细胞的数目比较Table 3 The number of - tubulin in subependymal zone of lateral wall of lateral ventricle in rat brain after intracerebral hemorrhage （s，n =10）GroupNormalModelTreatment 1.560.92 5.251.42a21.372.44b 1.451.03 6.031.63a27.753.42b1 d 3 d 7 d 1.321.48 4.931.38a19.104.71baP 0.05, vs. normal group, bP 0.01, vs. model group3 讨论目前研究认为成年侧脑室SVZ的NSC除自我复制外，新生细胞可分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元，但正常脑内增殖速度十分缓慢4，14-17。关于三七总皂苷及脑出血对成年脑内这一神经发生部位影响的国内报道较少9-14。本实验发现脑出血后损伤侧前脑侧脑室外侧壁SVZ的PCNA、GFAP、Tuj-1阳性细胞表达增强，结果提示脑出血能激活SVZ细胞，导致增殖和分化，三七总皂苷具有促进作用。3.1 三七总皂苷具有促进脑出血大鼠侧脑室SVZ细胞增殖的作用 本实验发现三七总皂苷能明显增强脑出血大鼠损伤侧前脑侧脑室SVZ的PCNA阳性细胞表达，且很多阳性细胞呈分裂相，说明三七总皂苷具有促进脑出血后侧脑室SVZ细胞增殖的作用。 3.2 三七总皂苷具有促进脑出血大鼠侧脑室SVZ细胞迁移和分化的作用 脑出血后大鼠前脑侧脑室外侧壁SVZ细胞表达GFAP、Tuj-1，提示SVZ细胞出现了分化，产生了新的星形胶质细胞和神经元。三七总皂苷干预后，SVZ细胞的分化增强。本实验还发现三七总皂苷能促进PCNA、GFAP、Tuj-1阳性细胞沿胼胝体呈条带或流状表达，形成从外侧壁SVZ上部向病灶周围的条带状迁移流，还出现自外侧壁SVZ下部向病灶周围的流状迁移，这部分工作还有待进一步研究8-9。4 参考文献1 Li JW，Zhu PC，Si YC，et al.Zhongyiyao Xuekan 2003;21(1):205-220 李巾伟，朱培纯，司银楚，等.脑出血大鼠前脑抑凋亡基因bcl-2的表达及三七总皂苷的影响J.中医药学刊，2003，21(1):48-502 Li JW，Zhu PC，Si YC，et al.Beijing Zhongyiyao Daxue Xuebao 2003;26(2):22-25 李巾伟，朱培纯，司银楚，等.三七总皂苷对脑出血大鼠前脑促凋亡基因caspase-3影响的研究J.北京中医药大学学报，2003，26(2):22-253 Si YC,Li JW,Zhu PC,et al.Zhongguo Yaolixue Tongbao 2005;21(10):1280司银楚，李巾伟，朱培纯，等.三七总皂苷对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体NR2A和NR2B表达的作用J.中国药理学通报，2005，21(10):12804 Gritti A, Bonfanti L, Doetsch F, et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci 2002； 22(2):437-4455 Cheng L,Zhu PC,Si YC,et al.Beijing Zhongyiyao Daxue Xuebao 2003;26(3):18-20程龙，朱培纯，司银楚，等.三七总皂甙对去大脑皮层血管后成年大鼠前脑侧脑室室管膜下层Nestin和bFGF表达的作用J.北京中医药大学学报，2003， 26（3）：18-206 Cheng L,Zhu PC,Si YC,et al.Zhongyiyao Xuekan 2003;21(5):687-689 程龙，朱培纯，司银楚，等.去大脑皮层血管成年大鼠前脑bFGF和PCNA的表达及三七总皂甙作用研究J.中医药学刊，2003，21（5）：687-6897 Zheng JM,Zhu PC.Jiepouxue Zazhi 2001;17(2):121-126 张俊敏，朱培纯.脑出血对大鼠前脑碱性成纤维细胞生长因子影响的实验研究J.解剖学杂志，2001，17（2）：121-1268 Zhu PC,Cheng L,Si YC,et al.Shenjing Jiepouxue Zazhi 2006;22(1):21-26 朱培纯，程龙，司银楚，等.成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成迁移路至损伤部位 (二)来自背外侧脑室下区的祖细胞形成迁移路经胼胝体至损伤部位J.神经解剖学杂志，2006，22（1）：21-269 Zhu PC,Cheng L,Si YC,et al.Shenjing Jiepouxue Zazhi 2005;21(6):583-589 朱培纯，程龙，司银楚，等.成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成