胞膜和胞内抗原如何同时标记.doc

胞膜和胞内抗原如何同时标记 胞膜和胞内抗原同时标记的具体步骤如下:1 膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量抗凝骨髓（或其他类型）标本，充分混匀后室温避光孵育15min2 溶血：加入1XFACS溶血素2ml，低速涡流混匀，室温避光静置8-10min3 洗涤：弃去上清，加入1ml PBS洗液，300g离心洗涤5min4 透膜与固定：用透膜剂处理，固定细胞膜并使其通透。在此介绍两种透膜剂的使用方法：BD FACS和CALTAG 透膜剂。 BDFACS透膜剂的使用：加入500ul透膜剂，低速涡流混匀，温室作用10min，加1ml PBS，300g离心300min。CALTAG透膜剂的使用：加入100ul透膜剂A液，低速涡流混匀，室温作用15min，加PBS 1ml，300g离心5min，弃去上清，加入100ul透膜剂 B液，同时加入相应的荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育15min。5 细胞内抗原染色：加入相应的荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育30min（CALTAG透膜剂省去此步骤）6 洗涤：弃去上清，加入1ml含有1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，300g离心洗涤5min。7 上机检测：弃去上清后加入PBS 200ul，上机检测。如不能及时上机检测，则加入0.5ml 1%多聚甲醛，混匀后置于4冰箱内保存后检测。值得注意的是，在标记ckappa和clambda时，在标记细胞前先用无血清PBS洗涤3遍，然后进行跑膜抗原标记、溶血、洗涤、胞内抗原标记和洗涤、上机检测。（1）细胞内细胞因子的测定细胞因子在细胞系统调节中起着非常重要的作用，常用检测方法是以分泌后释放至外部环境的细胞因子检测为基础，一般来说选用酶联免疫吸附实验ELISA或放射免疫分析法RIA，虽然敏感且可以定量，但测定的是每单位体积中细胞总体分泌的平均细胞因子水平。为了界定产生某种细胞因子的细胞类别、表型、层顶实际产生细胞因子的细胞数量或比例，有必要寻找新的方法检测单细胞内的细胞因子。目前常用的方法有酶联斑点免疫技术ELISPOT和流式细胞术，后者是一种有效的分析单个细胞的技术，可同时分析多个参数，可从单细胞水平检测不同亚群产生的细胞因子，不但能了解细胞因子的量和产生细胞因子的细胞类型，而且可以检测同一细胞内分泌的不同细胞因子。 胞内细胞因子检测的基本原理：通过应用细胞内蛋白分泌抑制剂，如莫能菌素和布雷非尔德菌素，阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，使细胞因子聚集、蓄积，不能分泌到细胞外，增强了细胞因子信号。结合膜表面抗原染色，进行流式细胞分析。方法如下：1） 单细胞悬液的制备2） 细胞的活化：除检测高封堵的和病理情况下表达异常亢进的细胞因子，可直接标记细胞外，一般先活化细胞，使之合成欲检测的细胞因子。活化T细胞除用抗原外，还有植物凝集素PHA，佛波酯PMA，钙离子载体，T细胞受体抗体和CD3抗体等；活化B细胞除抗原外，还可以用脂多糖LPS，金黄色葡萄球菌肠内毒素A及B细胞受体抗体。活化单核细胞可用LPS和某些细胞因子等。一般可将激活剂配成一定浓度加入血液或单核核细胞悬液中，同时加入一定浓度的莫能菌素或BFA，培养一定时间如4-6H后即可刺激淋巴或单核细胞产生细胞因子。3） 细胞表面抗原和细胞内细胞因子的染色：收集细胞，收集上述活化的细胞封闭FC受体：加入过量的来源于抗体生产动物同种属动物的无关的纯化免疫球蛋白IG（1-10ug/10e6细胞）或FC受体的抗体，可以阻断与单克隆抗体的非特异性结合。细胞表面抗原染色：选择适当的荧光素标记抗体和适量活化细胞，按照膜表面抗原染色法进行染色。固定和透膜：全血标本加入2ml BD 1XFACS溶血素溶解红细胞，室温放置8-10min，300g离心5min，弃去上清；加入2mlPBS，低速涡流混匀，500g离心5min，弃去上清。加入500ul 1X BD透膜剂，低速涡流混匀，室温10min，300g离心5min，弃去上清。细胞内细胞因子染色：加入适当浓度的荧光素标记的细胞因子抗体，4避光孵育30min。洗涤：弃去上清，加入1ml含有0.1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，300g离心洗涤5min。上机检测：弃去上清后加入PBS 200ul，上机检测。4） 染色对照：细胞内细胞因子涉及体外细胞激活或培养过程，设置阳性对照和阴性对照对于结果的分析非常重要。阳性对照：可利用一系列产生特定细胞因子的细胞系或预先经活化并被固定的阳性对照为对照细胞。阴性对照：反应单克隆抗体的非特异性结合水平，包括免疫球蛋白同型对照、配体封闭对照和未标记抗体封闭对照。免疫球蛋白同型对照：指用非相关特异性的同型匹配抗体作为对照。配体封闭对照：指的是预先用同类的细胞因子与荧光