神经干细胞及前体细胞治疗脑胶质瘤的研究.doc

神经干细胞及前体细胞治疗脑胶质瘤的研究神经干细胞及前体细胞治疗脑胶质瘤的研究胶质瘤病友中心：249158778胶质瘤交流沟通的平台9.1 应用细胞进行靶治疗概况9.2 神经干细胞及前体细胞治疗脑胶质瘤 9.2.1 原发性前体细胞与永生化前体细胞9.2.2 永生化神经干细胞的迁移及整合效率9.3 结论中枢神经系统的神经干细胞及前体细胞具有三个特征：1）高度的迁移性；2）对中枢神经系统病理性区域具有亲嗜性；3）多潜能性，能够修复中枢神经系统的损伤脑组织。由于神经干细胞具有以上特征人们可以利用神经干细胞及前体细胞作为基因治疗的载体治疗中枢神经系统疾病，利用干细胞的迁移性和亲嗜性可以直接将治疗因子输送到病变组织发挥治疗疗效。胶质瘤是一种广泛浸润的肿瘤，手术难以完全切除肿瘤组织，而残存的肿瘤细胞是肿瘤复发的根本原因，如何杀伤残存的肿瘤细胞是提高胶质瘤治愈率的关键，因此寻找新的治疗策略杀伤浸润到正常脑组织当中的残留肿瘤细胞成为治疗本病的重要课题。利用含有治疗因子的工程化干细胞及前体细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法，同时该工程化的细胞能够定向分化、修复并替代周围损伤的组织。目前关于利用工程化神经干细胞及前体细胞治疗脑胶质瘤正成为胶质瘤治疗的研究焦点。9.1应用细胞进行靶治疗概况目前已能分离多种细胞，然后在体外进行基因工程化然后回输体内进行细胞治疗，这些细胞包括来源于中枢神经系统的神经元、星形细胞和少枝胶质细胞及肾上腺髓质、坐骨神经、雪旺氏细胞及后根神经节；来自于非神经组织的包括肌肉细胞、成纤维细胞、绒毛膜、巨噬细胞及造血干细胞等；来源于肿瘤细胞株如嗜酪细胞瘤、神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、雪旺氏细胞瘤及正常细胞株如成纤维细胞株及星形细胞株。最近人们利用神经干细胞作为基因治疗的载体治疗神经系统疾病，早期神经干细胞主要治疗递质减少的某些神经退行性病变 。如应用干细胞修复旋转鼠的髓鞘病变，应用工程化的神经干细胞作为包装细胞进行移植后转染周围的神经元及神经节，干细胞进行治疗的优点在于它不仅治疗脑内的疾病，而且干细胞还能分化成功能性神经元和神经节从而修复神经功能。目前关于神经干细胞对脑内病变区的趋向性的机制尚未阐明，可能与细胞因子、营养因子及细胞外基质有关。9.2神经干细胞及前体细胞治疗脑胶质瘤已发现有多种干细胞具有神经元潜能，另外通过干细胞永生化制备提供持续性的干细胞研究材料。但应注意年龄、干细胞的组织来源部位及传代次数均影响干细胞的特点（图9-1-1）。图9-1-1 Schematic outline of how stem cell expansion A.i) S: NSC cell， T: likely transient amplifying precursors; ii) two NSCs are generated;iii) giving rise to one NSC and apoptotic cell; iv)NSCs expansion. B: neurosphere: transient amplifying precursors，dead/dying cells早期神经系统的发育显示干细胞的发展沿着前/后轴、背/腹轴发展，神经干细胞的这种分化有利于正常神经系统发展和神经元突触的形成，神经干细胞的这种分化提示在早期神经外胚层的发展过程中从开始干细胞就表现出可变化的特点 。从开始干细胞就可以分为区域性和暂时性提示在移植研究当中每一种干细胞的迁移、定向和分化能力是不一样的，这种神经干细胞的不同将会影响神经干细胞作为靶点治疗及重复以往的实验所获得结论，到目前为止有四种类型干细胞具有治疗颅内肿瘤的潜能。9.2.1原发性前体细胞与永生化前体细胞到目前为止仅有一项研究比较了原发性前体细胞与永生化前体细胞的功能。Benedetti等比较了非永生化小鼠的皮层前体细胞与来自于大鼠壳核的永生化前体细胞对抑制肿瘤生长的能力和对同种异体肿瘤获得性免疫反应的能力进行了比较，首先分别对具有免疫能力的小鼠和大鼠进行同种异体G1261和C6细胞移植，来源于小鼠的原发性神经干细胞及大鼠的永生化前体细胞工程化，能够分泌IL-4，这些工程化的前体细胞与胶质瘤细胞同时注射于动物当中或注射于57天的胶质瘤动物模型中，直接注射时没有证据显示肿瘤生长。1）初始性前体细胞的分离：Benedetii从新生小鼠的皮层当中分离非永生化的前体细胞放入含有EGF和FGF的培养基当中进行培养，收集神经球，将神经细胞分离，第4天在同样的培养基当中再培养，每3-4天传代一次，采用含有IL-4基因的逆转录病毒载体转染，G418筛选1周，然后免疫测定IL-4的分泌。2）永生化前体细胞的产生：从SD大鼠的尾状核分离获得初始性前体细胞，通过温度敏感的SV40T抗原变异体转染成永生细胞株ST14A。在体外该细胞的培养条件为33，39不能生长，体内实验发现该细胞能够分化成胶质细胞和神经元，通过含有IL 4的逆转录病毒转染该细胞株并筛选出细胞株(ST14A IL-4.3)进行传代。3）肿瘤生长抑制：在体外胶质瘤细胞株GL 261与C6分别用含有培养前体细胞C57.npr与ST14A的培养基进行培养，通过3H 胸苷掺入试验发现GL-261和C6肿瘤细胞株生长减慢，在含有C57.npr的培养基与正常培养基相比，24h后其掺入率降为84 7%；39培养的ST14A培养基可引起C6胶质瘤细胞50%的生长，而在33的培养基未能影响细胞的增殖。Benedetti等研究发现干细胞分化过程中的培养基能够抑制肿瘤的生长，而已分化好的干细胞的培养基缺乏这种能力，他们推测前体细胞能够在分化过程中分泌某些因子于培养基当中从而抑制肿瘤的生长。4）过继性免疫治疗：Benedetti等研究发现颅内胶质瘤的动物模型当中注射IL-4可诱导产生免疫反应和肿瘤消退 。同样Benedetti等发现联合注射C57nprIL-4和GL261胶质瘤细胞，小鼠的生存期较单纯注射GL261明显延长，其中7只小鼠当中有6只其存活期超过90d，而对照组当中7只小鼠无一只存活超过90天，单纯C57前体细胞组存活期也明显延长；相同的研究发现C6细胞与ST14AIL-4(分泌IL-4的前体细胞)共注射，50%的动物存活期超过90天，而C6细胞组与ST14A前体细胞共注射，其存活期较单纯对照组明显延长，但较分泌IL-4的前体细胞组其生存期短，该研究显示神经干细胞能够对胶质瘤产生有效的过继性免疫反应从而抑制肿瘤的生长。 9.2.2 永生化神经干细胞的迁移及整合效率以往研究显示神经干细胞注射到胚胎发育中的小鼠(mouse)脑内，干细胞具有迁移和整合作用。Snyder等证明多种病理病变如脑梗死、脑损伤和脱髓鞘病变对永生化的神经干细胞具有趋向性，当干细胞迁移到病变组织后可分化成神经细胞、星形细胞、少枝胶质细胞。1）细胞株的制备：C17.2细胞是一种永生化的细胞株，来源于新生小鼠(neonatalmice)小脑的外颗粒层细胞，在含有EGF和FGF的培养基当中进行培养，其神经球用含有V-myc和半乳糖苷酶(LacZ)基因的逆转录病毒载体转染并筛选而获得。2）迁移能力：Aboody及Herrlinger等最近研究发现C17.2前体细胞能够向小鼠和大鼠脑内异种移植的胶质瘤迁移几个毫米。另外Aboody研究显示C17.2前体细胞可以从一个半球迁移到另一个半球，甚至采用尾静脉注射前体细胞能够达到脑内的肿瘤，但这些结果并不能证明干细胞的迁移是通过没有明显组织间隙的细胞组织之间进行迁移的。干细胞是否通过破坏紧密连接或重新形成基底膜目前还不十分清楚，他们的迁移是否通过脑内血管进行?是否通过一些细胞表面黏附分子或形成迁移通道，这些问题对干细胞的应用十分重要，它涉及如何有效的输送干细胞及充分利用干细胞的潜能。3）修饰产生复制型I单纯疱疹病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)。Herrlinger等修饰C17.2细胞株使他们产生条件性的单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，这种病毒的感染和复制仅限于分裂细胞，48-72h后可引起细胞死亡。C17.2细胞被HSV-1病毒感染，然后用mimosine或mimosine联合gancylovir治疗，抑制细胞的增殖，被感染的细胞注射到已建立的裸鼠脑内肿瘤模型的脑内。3d后，x -gal染色观察C17 2细胞的部位，结果显示C17 2位于整个瘤床及附近的侵入脑实质内的小的肿瘤，单纯疱疹病毒，酪氨酸激酶蛋白(herpes simplex virus tyrosine kinase protein，HSV TK)免疫组织化学显示感染的细胞位于肿瘤及周围的脑实质内。条件复制病毒与干细胞的结合能够定位肿瘤组织和滤出的肿瘤细胞，显示该方法能够有效辨别靶肿瘤与正常的脑实质。4）输注胞核嘧啶脱氨酶诱导肿瘤细胞死亡：Aboody等将胞核嘧啶脱氨酶(cytosine deam inase，CD)转染C17.2细胞，胞嘧啶脱氨酶能够激活前药3，5 氟胞嘧啶(5-FC)转变成5 氟尿嘧啶(5-FU)，该碱基能够干扰DNA复制而引起增殖细胞的死亡。然后采用肿瘤内或脑室内注射细胞于中枢神经系统肿瘤的裸鼠的脑内，注射部位位于同侧或对侧半球或与肿瘤有一定的距离或采用尾静脉的方法注射，2-7d后确定干细胞所在的位置，结果显示C17.2CD多数位于肿瘤边沿，部分渗出到整个肿瘤瘤体，治疗组较对照组肿瘤体积降低80%，并发现远离肿瘤瘤体的肿瘤细胞与C17.2CD的接触，腹腔内注射5-FU(900mg/kg)超过10d。该细胞治疗肿瘤的机制在于定向输送了激活前药的胞嘧啶脱氨酶干扰了DNA的肿瘤细胞的复制，增加了DNA复制依赖的5-FU的疗效。9.3结论研究显示在异种动物肿瘤模型的肿瘤内注射原始皮层前体细胞、永生化的纹状体前体细胞及永生化的小脑前体细胞显示干细胞与肿瘤细胞有整合作用。另外Benedetti等发现干细胞具有抑制肿瘤生长的作用，并证明皮层和纹状体前体细胞能够诱导产生抗肿瘤的I