果蝇大实验综合版.doc

果蝇大实验一、实验目的 1、了解果蝇的生活史，识别雌雄，观察常见的几种突变型；2、通过果蝇的杂交实验，验证独立分配，伴性遗传，连锁遗传规律。二、实验材料果蝇(2n=8)三、实验用具及药品1、仪器用具 解剖镜、恒温箱、培养瓶、麻醉瓶、白瓷盘、标签 2、药品试剂 乙醚、玉米粉、蔗糖、琼脂、丙酸、酵母粉、酒精3、培养基 玉米粉培养基：琼脂糖和玉米粉，加上酵母使其发酵，加入丙酸，目的是一来防止霉菌生长，二来果蝇偏好丙酸的味道四、实验原理(一)果蝇的生活史及形态观察 1、生活史观察 (1)卵 成熟的雌蝇交尾后(23d)将卵产在培养基的表层。用解剖针的针尖在果蝇培养瓶内沿着培养基表面挑取一点培养基将其置于载玻片上，然后滴上1滴清水，用解剖针将培养基展开后放在显微镜低倍镜下仔细进行观察。果蝇的卵为椭圆形，长约0.5mm ，腹面稍扁平，前端伸出的触丝可使卵附着在培养基表层而不陷入深层。(2)幼虫果蝇的受精卵经过一天的发育即可孵化为幼儿虫。幼虫在培养基内及瓶壁上都有，培养基内的幼虫一般要小一些。这是因为果蝇的幼虫从一龄幼虫开始经两次蜕皮，形成二龄和三龄幼虫，随着发育而不断长大，三龄幼虫往往爬到瓶壁上来化蛹，其长度可达45mm 。幼虫一端稍尖为头部，黑点处为口器。幼虫在培养基内和瓶壁上蠕动爬行。 (3)蛹 幼虫经过45d的发育开始化蛹。一般附着在瓶壁上，颜色淡黄。随着发育的继续，蛹的颜色逐渐加深，最后为深褐色。在瓶壁上看到的几乎透明的蛹是已经羽化完而遗留的蛹的空壳。(4)成虫 刚羽化出的果蝇虫体较长，翅膀也没有完全展开，体表未完全几丁质化所以成半透明透乳白色。随着发育，身体颜色加深，体表完全几丁质化。羽化出的果蝇在812h后开始交配，成体果蝇在25条件下的寿命为37d 。 2、雌雄鉴别 为了准确地配制果蝇的杂交组合和果蝇遗传性状分析，必须首先能够正确辨别果蝇的性别。 (1)麻醉 对果蝇实施麻醉是为了便于性状观察和转移果蝇，因此麻醉时一定要根据实验目的的而确定麻醉的深度。如果只是进行观察，可以将果蝇麻醉至死。死亡时表现为翅膀与身体呈45度角。但如果是麻醉鉴别后再进行转移培养，就应避免麻醉至死。麻醉时，在麻醉瓶的瓶盖内塞入沾有乙醚的棉花，待乙醚气体在瓶内充满后将果蝇培养瓶的瓶口与麻醉瓶口对准，将果蝇转入麻醉瓶内，盖好瓶盖。观察果蝇的表现，若果蝇从瓶壁上纷纷落到瓶底，表示麻醉已生效。转移麻醉后的果蝇时，应用毛笔的笔尖粘取。(2)观察将麻醉后的果蝇放在解剖镜下仔细观察，区别雌雄的差异。可以着重从以下几方面观察雌雄果蝇主要差异，见表1 。 表1 雌雄果蝇主要差异比较 雌蝇雄蝇体型较大无性梳腹片数为6腹部背面5条黑纹腹部底部为产卵管，呈现圆锥状凸出体型较小前肢先端第二节有性梳腹片数为4腹部背面3条黑纹最后一条延伸至腹面成一黑斑腹部底部为交尾器，呈现黑色圆形外观在雌雄差异中，以性梳的差异最为准确。如刚羽化出的果蝇，身体都较和长，颜色很浅。但是，用性梳的有无就可以很快将雌雄分开，在熟练操作几次后，就可以不必借助解剖镜也能很快区分雌雄。在观察性梳时可以用解剖镜观察，也可以用低倍的显微镜观察。 3、突变型观察 将果蝇麻醉后，在解剖镜下仔细辨认各种突变类型。与野生型果蝇作对照，观察突变型果蝇的性状表现，如残翅、黑体、黄体、白眼等。经过一段时间的练习，可以直接区别各种不同性状。果蝇中的一些突变性状和控制该性状的基因如表2 所示。 表2 果蝇中的一些突变性状及特征 突变型基因符号表现特征白眼褐色眼猩红眼黑檀体黄体卷刚毛黑体残翅翻翅短翅wbwsteysnbvg Cym复眼白色复眼褐色复眼猩红色身体乌木色身体浅橙黄色刚毛卷曲烧曲焦状颜色比黑檀体深翅退化，不能飞翅向上翻卷，纯合致死翅膀短小，不超过身体(二)常用的性状与基因型个体1、性状 (1)体色：灰（显）黑（隐） 在染色体上(2)刚毛：直（显）卷（隐） (3)翅形：长（显）小（隐） 在性染色体X上(4)眼色：红（显）白（隐）2、基因型个体(1)野生型：灰体，直刚毛，长翅，红眼(2)三隐性：灰体，卷刚毛，小翅，白眼(3)黑体：黑体，直刚毛，长翅，红眼(三)理论依据1、独立分配规律果蝇的体色和眼色性状由位于非同源染色体上的两对等位基因控制遗传。用正交的方法，将黑体、红眼(aaX+X+)雌蝇和灰体白眼 (AAXWY ) 三隐性突变体雄蝇杂交，则F1全为灰体红眼 (AaX+XW ,AaX+Y)，由F1自交产生的F2中，灰红:灰白:黑红:黑白=9:3:3:1。用反交的方法，将灰体白眼(AAXWXW)三隐性突变体雌蝇和黑体红眼(aaX+Y)雄蝇杂交，则F1中灰红：灰白=1:1，由此产生的F2中灰红:灰白:黑红:黑白=3：3：1：1。2、伴性遗传红眼与白眼是一对相对性状，控制该对性状的基因(W)位于X染色体上，且红眼(W)对白眼(w)为完全显性。当红眼雌蝇与白眼雄蝇杂交时，无论雌雄均为红眼，F2中红眼:白眼=3:1，但雌蝇全为红眼，雄蝇中红眼:白眼=1:1；反交时F1中雌蝇为红眼，雄蝇为白眼，F2中红眼:白眼=1:1，雌蝇和雄蝇中的红眼与白眼的比例均为1:1。3、连锁遗传验证连锁遗传规律可用三点测验。三点测验就是将白眼、卷刚毛、小形翅(wsnm/wsnm)三隐性突变体雌蝇与红眼、直刚毛、长翅(+/Y)野生型雄蝇杂交，则F1可产生三杂合体雌蝇(wsnm/+)和三隐性雄蝇(wsnm/Y)。由于Y性染色体上不携带相应的等位基因，因而三隐性雄蝇表现出X染色体上三个隐性基因所控制的性状，它相当于一个三隐性纯和个体。用F1三杂合体雌蝇和三隐性雄蝇测交，通过观察和统计测交后代各种表现型的个体数，就可以估算出这些基因间的交换值，由此确定基因在染色体的相对位置，绘制出连锁遗传图。 (四)实验方案1、独立分配规律考察性状：体色、眼色（基因位于不同染色体上）正交： P 黑体(aaX+X+)三隐性(AAXWY) F1 灰体红眼 (AaX+XW ,AaX+Y) F2 (灰红9:灰白3:黑红3:黑白1)反交： P 三隐性 (AAXWXW) 黑体(aaX+Y)F1 灰体红眼:灰体白眼 (AaX+XW:AaXWY)F2 (灰红:灰白:黑红:黑白)2、伴性遗传考察性状: 眼色，性别正交： 反交：P X+X+ XwY P XwXw X+Y 配子 X+ Xw Y Xw X+ YF1 X+Xw X+Y XwX+ XwYF2 X+X+ X+Y X+Xw XwY XwXw X+Y X+Xw XwY红眼与白眼的比例为3:1 红眼与白眼的比例为1:1 没有白眼雌蝇雌雄各占一半隔代遗传交叉遗传3、连锁遗传考察性状：眼色，刚毛，翅形（三点测验）P 三隐性(XwsnmXwsnm) 野生型(X+Y)F1 （三杂合体）XwsnmX+ ， XwsnmY（三隐性） 配子 Xwsnm,X+,Xw+m,X+sn+ Xwsn+,X+m,X+snm,Xw+ XwsnmY 姊妹交 Ft五、实验步骤1、5人/组，每组三个杂交组合（三管/组），每管5只雌蝇，3只雄蝇，三个组合分别为：(1)独立分配规律：体色、眼色 黑体 三隐性 三隐性 黑体(2)伴性遗传：眼色、性别 黑体 三隐性 三隐性 黑体(3)连锁遗传：眼色、刚毛、翅形三隐性 野生型2、70%酒精棉球将镊子、白瓷盘擦干净，手指及毛笔消毒；3、仍需饲养的果蝇宜轻度麻醉，以便复苏；4、准备继续饲养的果蝇，应在苏醒前应用毛笔将其移入横卧于桌上；的培养瓶中，完全苏醒后再将培养瓶竖起；5、每个杂交组合贴上标签，标明组合(如黑体 三隐性 )、班级、小组号、时间等。六、注意事项 1、果蝇适度麻醉，挑蝇用毛笔，忌用镊子和其他工具，以免影响果蝇生长繁育。 2、雌果蝇生殖器官有受精囊，可保存交配所得的大量的精子，能使大量的卵细胞受精。因此在做果蝇杂交实验的时候，亲本雌果蝇必须是处女蝇，保证实验结果的可靠性。3、如果要验证选取的处女蝇是否准确，先不要放入雄蝇，3天后看雌蝇是否产卵，如果产卵就不是处女蝇了。当证明确实是处女蝇的情况下再放入雄蝇，进行遗传杂交实验。4、掌握处女蝇的选取时间且所选材料要合格，便于实验。5、选取处女蝇时麻醉剂量适当，避免过量伤害果蝇甚至将其杀死。6、纯计数时应将果蝇处死，便于辨认性状和区分。7、挑处女蝇时，每次只挑12小时内羽化成虫，超过12小时的成虫已逐渐有交配能力，必须一只不留地倒出，才能进行第二次挑选。8、每个杂交组合放果蝇4对，用毛笔把果蝇扫进试管，试管要平放，待蝇醒后，方能竖起，避免果蝇粘在培养基上被闷死，杂交组合配好后，放回培养箱。9、操作过程中注意不要将棉塞等放到桌面，避免染菌。10、尽量避免由于操作不当造成的果蝇的逃逸，这样会对最后的结果产生影响。11、培养箱温度保持25，不要随意更改或调整其他旋钮，以免影响整个实验。12、F1代培养出后，亲本果蝇应除干净。13、刚羽化的果蝇色淡白，体软绵，难辨，需要观察性梳辨别。14、两周后停止对F2代的计数，否则可能已有F3代混入影响结果。果蝇的某些性状可能会受到环境之类的影响从而出现与理论不相符的结果。15、因为此次实验的连续性很强，所以一定要注意每一步的时间和操作，否则就会产生不可逆的后果，严重的要进行重做。16、培养瓶灭菌应彻底，严格控制温度，实验环境整洁。17、配制玉米粉培养基时应搅拌均匀且温度保持在80度以上。18、挑果蝇时，除了要注意雌雄外，还要注意性状，防止因果蝇混杂而引起实验结果的失败，不可麻醉过度。19、放到培养瓶中时要先把瓶子倾斜，待果蝇苏醒后再把瓶子竖起来，防止果蝇粘在培养基中而不能苏醒。20、如果瓶壁上沾有培养基，用酒精棉球擦干净。21、养成良好习惯，保持实验环境整洁，最后清洗培养基时，不要将培养基倒入下水道避免堵塞，可以用塑料袋装好丢进垃圾桶。七、实验结果1、独立分配规律世代统计日期正交: 黑体(aaX+X+)三隐性(AAXwY)反交：三隐性(AA XwXw)黑体(aaX+Y)灰红灰白黑红黑白灰红灰白黑红黑白F25月6日231712110335月10日2711124735149总计实际观察个数50128368451712理论比例93313311理论个数41.113.713.74.653.353.317.617.6卡方值5.027.2P0.10 - 0.200.05 0.10数据分析：(1)正交：P = 0.05 ,说明差异不显著，即符合独立分配规律。(2)反交：P = 0.05 ,说明差异不显著，即符合独立分配规律。但是，由于果蝇太少，所以从计算所得的数据来看非常接近0.05，由此可见，果蝇数目的多少对于实验结果的正确得出具有重要的意义。2、伴性遗传世代统计日期正交：(黑体)X+X+(三隐性)XwY反交：(三隐性)XwXw(黑体) X+Y雌雄雌雄红白红白红白红白F25月6日1216177555月10日194852817147总计实际观察个数31514635241912理论比例20111111理论个数280141422.522.522.522.5卡方值无(分母有0)12.4P 0.01数据分析：(1)正交：理论上白眼雌蝇应该没有，但是实验结果中出现了，其原因可能是：亲本雌蝇不全是处女蝇，还有可能是在雌蝇雄蝇判断上判断错误。(2)反交：P = 0.006 0.05,说明差异显著，不符合规律。此实验结果与理论不符。原因是：一方面果蝇的数目太少，另一方面可能是性状计数时出错。还有的可能是果蝇性状出现了突变。3、连锁遗传测交后代的表现型第1次统计个数第2次统计个数总计根据测交后代的表现型推知F1配子种类交换类别红长直242852+ + +亲型白短卷151227w m sn亲型红长卷3710+ + sn双交换型白短直347w m +双交换型红短卷123+ m sn单交换型白长直2810w + +单交换型红短直7916+ m +单交换型白长卷5914w + sn单交换型双交换值：17/139=12.2w 和 sn之间的交换值： （10+3）/139 + 12.2 =21.6sn和m之间的交换值：（16+14）/139 + 12.2=33.8w 和 m 之间的交换值：21.6+ 33.8=55.4遗传图谱：w sn m 21.6 33.855.4数据分析：由于实验数据异常，统计量最小的两个遗传性状不全为双交换型，由此计算，得到的遗传图谱与理论相差很大。虽然结果很不理想，但是我们组员巩固了三点测验的方法，同时也深刻地体会到实验严谨科学认真的重要性，更重要的是，学会分析实验结果与理论值存在偏差的原因，并从中汲取教训。八、问题讨论1、实验结果与预期值存在一定的偏差，经小组讨论分析，原因有以下几个方面：(1)收集的果蝇数量仍然不够多，得到的结果偏差就大。(2)因为实验中温度、以及实验失误等原因导致收集到的果蝇在某些性状上数量偏少或者偏多，而影响实验结果。(3)部分新羽化的果蝇黏死在培养基上，导致表型无法识别。(4)杂交所利用的基因附近恰好有其他对果蝇生存力有影响的基因。(5)将F2个体误记入F1数据。(6)每个人的操作不同也会产生误差，比如说在观察性状和统计结果时，有些性状不明显，可能产生错误，将产生数据误差。(7)在挑选果蝇和杂交亲本时，麻醉过度，导致果蝇变异，对后代的性状比产生影响。(8)光照对果蝇有一定的影响，每次观察性状的时候时间控制不定，其影响不同，对果蝇的发育也不同，其后代的比例也就不同。2、果蝇至今仍是遗传学、细胞生物学、分子生物学和发育生物学等研究中最为成熟的模式生物，作为遗传学研究材料，果蝇具有很多优点：(1)个体小，易于饲养，培养成本低廉，生活