对二氯苯对湿地土壤细菌群落多样性的影响.doc

对二氯苯对湿地土壤细菌群落多样性的影响摘要：利用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳（）考查了对二氯苯胁迫对湿地土壤细菌群落多样性的影响。通过不同培养时间（、和 ）和不同培养浓度（、和 ）对二氯苯污染下湿地土壤细菌群落基因组的变性梯度凝胶电泳（）多样性分析。结果表明，各处理下的土壤细菌群落多样性在不同处理时间有明显差异。培养初期对二氯苯对土壤细菌群落抑制作用非常显著，土壤细菌中某些群落的生长受到抑制；不同处理在处理后期差异很小。在土壤培养初期，含对二氯苯 的培养基上出现一条新增条带，为对照和低浓度对二氯苯土壤所没有，说明土壤中存在对二氯苯生长优势菌。关键词：变性梯度凝胶电泳（）；对二氯苯；湿地土壤细菌菌群；多样性： ，（， ） （， ） ， on differed ， ， 1，4 ， indicating resistant to 1，4 ： ； ，； ； 土壤微生物在土壤生态中扮演了重要角色，并且参与地球生物生态系统的化学循环，进行污染物质的降解，。但是由于土壤微生物个体微小、数量众多、土壤环境条件复杂等原因，用常规的分离培养法很难全面有效地评估土壤中微生物群体多样性及环境污染对土壤微生物的影响，极大地限制了人们对土壤微生物的认识。伴随分子生物学技术在环境科学领域的不断应用，不经传统培养，直接从土壤中抽取出土壤微生物总，利用微生物遗传多样性及区系基因变化来进行污染物环境效应的评价，正在被广泛采用。研究排除其他因素，通过提取湿地土壤细菌群落总，经扩增、变性梯度凝胶电泳（），获得土壤细菌群落 序列分布，以此研究对二氯苯对土壤细菌群落多样性的影响。旨在为更直接更可靠地反映对二氯苯胁迫下湿地土壤细菌群落的组成情况，评估污染条件下土壤微生物的多样性。 材料与方法 供试土壤供试土壤取自盐城海滨湿地土壤，无人为污染。收集 处新鲜土壤，室内阴干，研磨，充分混匀，过目筛。 试验设计试验选择 的塑料桶，桶内加入 土壤，加入适量去离子水，使水面浸过土壤 。桶内加入配制好的对二氯苯母液，使桶内对二氯苯浓度分别为、和 ，每组次重复，室温 培养。培养过程中不断补水，保证水位高于土壤 。分别在第四天、第天和第天时，从桶内 深度处取土样 ，采集后的土壤样品 保存。 土壤中细菌群落的提取 土壤样品加 直径 玻璃珠，再加 磷酸缓冲液，混匀 ，室温 离心 ；提上清液，室温 离心 ，弃上清液，加入 消化液（ l， ， 磷酸钠， ， ， ）， ， 溶菌酶 ， 水浴 ，加 蛋白酶（ ）水浴 ；加 氯仿、苯酚混合物，混匀 ，室温 离心，留上清液，加等体积氯仿异戊醇 （，） 混匀 ；室温 离心 ，留上清液，加醋酸钠 离心 ，加 乙醇，室温 离心 ；弃上清液，倒置风干，加 缓冲液。取一定量样品进行的琼脂糖凝胶电泳，检测土壤细菌群落总 的提取质量。 扩增扩增反应体系：缓冲液 ，（ ） ， ，上下游引物各 ，模板 ，酶 （ ） ，加去离子水至50 。反应条件为： 预变性 ； 变性 ， 退火 ， 延伸 ，共进行个循环； 延伸0 。反应在 公司的型仪上进行。反应结束后取 反应液在的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。用于 的扩增反应的引物序列为：（）和（）。 变性梯度凝胶电泳和染色产物加入到（）聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶的变性范围为。利用型电泳系统，在 、 、 下电泳 。电泳结束后，用固定液（冰醋酸）固定凝胶 ，用去离子洗涤凝胶3次，每次 ，取出凝胶板竖起控水 ，将洗后的凝胶浸泡在染色液（含硝酸银和 甲醛的混合液）中 ，然后取出凝胶，在去离子水中浸洗 ，立即浸泡在显影液（含无水碳酸钠和 甲醛的混合液）中，缓慢地摇晃至条带完全显现。将凝胶置于中止液（ ）中浸泡 ，再用去离子水浸洗凝胶次，取出凝胶竖起控水。 指纹图谱生物信息学分析采用法计算各样品间的相似指数，指纹图谱分析借助于公司的凝胶成像系统进行条带判读，以配套软件 进行迁移率、强度、面积计算，并计算样品间的相似指数、绘制泳道间遗传图。 结果与分析 对二氯苯处理 后湿地土壤细菌群落总的分析图为不同浓度对二氯苯处理土壤 后土壤细菌群落分析结果。由图1可知，试验初期，不同浓度对二氯苯胁迫下湿地土壤细菌群落的基因条带出现较明显的差别。与对照相比，低浓度对二氯苯胁迫下条带变化不大，但其中条带、亮度变暗消失，条带、亮度增加。表明湿地土壤中大多数细菌群落对低浓度对二氯苯有一定的耐受性，基本不受影响，甚至对某类微生物具有一定的刺激作用，产生新条带，如条带。而 时，某些微生物对较高对二氯苯胁迫较为敏感，数量大大降低，达到分辨率下限。电泳图谱泳道间的遗传簇关系（图）同样印证了上述结果，在图中，对二氯苯浓度为 时与对照最为接近，第、第和第泳道则与对照的相似性为，较处理初期时明显降低。随着土壤中对二氯苯浓度的增加，土壤中细菌群落基因多样性受到的影响也逐渐增强，到土壤对二氯苯浓度为 时，整个泳道条带出现明显差别。值得注意的是，在土壤处理 时， 对二氯苯浓度下，出现一条新增条带，而对照及其他浓度下土壤都没有，说明土壤中可能有在对二氯苯较高浓度下良好生长的微生物种。 对二氯苯处理 土壤细菌群落总的分析图为不同浓度对二氯苯处理 土壤中细菌群落分析结果。由图3可知，在处理 时，与对照相比， 对二氯苯胁迫与对照土壤的细菌群落有的相似性，再次说明湿地土壤中大多数细菌对对二氯苯有耐受性，另一些细菌则受到了抑制，表现出条带亮度变暗，如图中的条带、。第和第泳道上出现的条带则表明在 和 浓度下有适应该浓度的细菌，在 浓度处理 时出现的新条带反映的可能是此种细菌，随着土壤中对二氯苯的挥发，原来 浓度降低至该种细菌能适应的浓度。由处理 时电泳图谱泳道间的遗传簇关系（图）可见，第、第和第泳道与对照的相似性为，较处理初期相比有所提升，而对二氯苯含量 的相似性也从处理初期的提高到了。造成这种情况的原因可能是随着对二氯苯的在土壤中的降解以及挥发，在土壤中的有效浓度降低，微生物的生长受到的抑制作用减小所引起的。值得注意的是，在土壤处理 时，原来在 浓度时出现的新条带也在 时出现了，而对照及其他处理都没有，更加肯定了此种微生物能适应土壤中适宜的对二氯苯浓度。 对二氯苯处理 土壤细菌群落总的分析对二氯苯处理 时土壤细菌群落电泳图谱与处理 时相比发生了较大的改变，各浓度对二氯苯处理下条带数目有所增加（图），在土壤培养 时，不同处理土壤样品之间差异开始变小，对二氯苯浓度为 时谱型与对照的相似性为，但亮度稍变暗；对二氯苯浓度为 时谱型与对照的相似度达到。图中不同处理谱型与对照的相似性都在以上，其中 处理时更是达到。表明在土壤培养 时，不同对二氯苯浓度的土壤样品之间的差异开始变小。 结论通过对不同处理时间、不同浓度对二氯苯胁迫下湿地土壤的细菌群落总进行多样性分析，结果表明，不同浓度对二氯苯对湿地土壤细菌组成产生了明显影响。不同浓度对二氯苯不仅影响了组成细菌群落的细菌种群数目，还使细菌群落结构以及多样性发生了改变。说明土壤细菌群落中各个种群是相互作用的，各土壤样品细菌群落遗传多样性是对各种群的群体性反映。但是细菌群落遗传多样性并不是简单地随着对二氯苯浓度提高而减小。在较低浓度对二氯苯污染的样点，图谱条带数目虽然变化不大，但组成图谱的条带亮度不同。说明不同种类的细菌不仅对对二氯苯的敏感性不同，而且对不同程度的对二氯苯污染敏感性也不同。考虑到细菌种群之间诸如偏利、协同、共生、偏害、竞争等复杂的关系，可能是一定程度的对二氯苯污染改变了群落内部种群之间的关系，某些对对二氯苯敏感的细菌的消亡或者一些耐受对二氯苯的细菌产生的抗性保护了其他种群的细菌。细菌群落的耐受性可能是因为后天适应、基因突变或者通过群落结构中种群组成的改变而更具有耐受性。对二氯苯污染土壤微生态环境与细菌多样性的内在关系主要表现在作用与反作用、抑制与适应、稳定与变异、诱导与重建的相互依存、相互影响、共同演化，其结果使得适应对二氯苯胁迫环境的优势菌群得以保留，群落结构和多样性发生变化，耐受性提高。在研究中，在土壤处理初期含对二氯苯 的培养土中出现一条新增条带，为对照及其他处理土壤所没有，处理后期随着对二氯苯浓度降低而消失，说明土壤中存在着适应对二氯苯适宜浓度而良好生长的细菌。参考文献： ， ，