显微操作法核移植的影响因素.doc

显微操作法核移植的影响因素1.受体细胞1.1 受体细胞的类型到目前为止，已有三类受体细胞用于核移植产生了后代，第一类是去核的合子，但此类受体局限于用原核或假原核作为供体。典型的例子是由Mc Grath和Solter1将原核移入去除原核的合子中获得了小鼠。第二类是早期胚胎，如Tsunoda等2将8细胞卵裂球移入去核的2细胞中获得了小鼠，这类受体也只适合于具有全能性的卵裂球。第三类受体即是M卵母细胞，这是哺乳动物核移植使用最多一类重要受体，用这一类受体接受各个阶段的卵裂球，早期胎儿细胞、体细胞或ES细胞均获得了后代。1.2卵龄选择合适卵龄的成熟卵母细胞作为胞质受体对核移植有很大的影响。一般选择成熟培养4044h的卵母细胞。Kazuchika等3研究发现24h成熟的卵母细胞与30h、42h的卵母细胞虽然其融合率和卵裂率没有显著差别，但是囊胚形成率却差异显著，分别为14.1%(22/156)、3.0%(5/168)、6.0%(13/217)。究其囊胚形成率高的原因可能在于能在24h内形成成熟的卵母细胞在成熟培养前大都能处在（应用荧光染色与压片技术显微观察卵母细胞内生发泡染色质构型的变化情况：通过核相判定方法将卵母细胞的核相分为待成熟受抑制状态的生发泡(Germinal vesicle，GV)期(根据发育程度进一步细分为GV期-GV期)和进入成熟状态的生发泡破裂(Germinal vesicle breakdown，GVBD)和之后的减数分裂(Meiosis，M)期(分为M期和M期，M进一步细分为中期、后期、末期)，以生发泡染色质构型、卵丘扩散程度、核成熟率和孤雌激活后卵裂率为主要检测统计指标）GV期-GVBD(胚胞破裂)发生时期之间，而在这个时期成熟的卵母细胞胞质成熟较好，从而能更有效地支持核重编程3。可见，尝试选择此时间成熟的卵母细胞做胞质受体也许能有效地支持核的重编程和重组。2 供体细胞对猪而言，体细胞核移植成功较晚，仅以猪的胎儿成纤维细胞4和颗粒细胞5作供体细胞，成功得到了核移植后代。Lee等6为了探讨哪种供体细胞更适合于作猪核移植的供体细胞，比较了猪胎儿成纤维细胞、成体的成纤维细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞作为核移植供体细胞构建的重组胚发育到囊胚的能力，以上4种细胞发育到囊胚的比率分别为15.9%、7.9%、5.8%、3.1%，结果显示：来源于40d胎龄的胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞产生的重构胚发育到囊胚的比率最高，为15.9%，细胞数目最多，平均的囊胚细胞数为31.23.2，显著高于成体的成纤维细胞、颗粒细胞、输卵官上皮细胞，其平均的囊胚细胞数分别为21.23.1，24.83.7，21.24.8，这些都在某种程度上暗示了用胎儿成纤维细胞作供体细胞进行核移植的优势。这也说明了供体细胞类型的选择对成功的体细胞核移植的重要性。3 供受体细胞周期同步化迄今为止，几例成功的猪体细胞核移植研究中，都采用了去核的成熟卵母细胞（M期）作受体。当用去核的M期卵母细胞作受体时，供体细胞的细胞周期选择尤为重要，必需使供体细胞与受体细胞的细胞周期同步化，这样才有助于重组胚的发育。Wilmut等认为供体细胞处于G0期对于成功的核移植是非常必要的，因为M期的卵子中存在高浓度的成熟促进因子（MPF），研究证明高浓度的MPF对于来源于分化的细胞的细胞核的再程序化是十分重要的。在MPF的作用下，构建的重组胚的细胞核发生核破裂（Nuclear Envelope Breakdown,NEBD）和早期染色体凝集（Premature Chromosome Condensation,PCC）。在卵母细胞激活后，MPF活性下降，染色质去凝集，在核膜重建的过程中DNA复制，染色体加倍。因而核移植时供体细胞周期的选择对于第一次细胞分裂末期，染色体二倍体的保持是很重要的。一种观点认为，G0/G1期的细胞在核移植前没有经历染色体的复制，染色体的数目为2C，当用其作供体细胞移植进M期去核的卵母细胞质中时，供体细胞核经历了NEBD和PCC，在核膜重塑的过程中DNA复制加倍，重构胚完成第一次减数分裂后能保持正常的二倍体，使胚胎正常发育。如果用G2/M细胞作核移植供体细胞，此时的细胞核已经经历了DNA复制，染色体为4C，当移入含高浓度的MPF去核的M期卵母细胞质中时，DNA再次复制，在重构胚胎完成第一次减数分裂后，就不能保持正常的二倍体，而为四倍体，这就造成DNA的损伤，使胚胎发育异常。4 去核去核即去除卵母细胞中的遗传物质。去核对于体细胞克隆有着决定性的影响。如果去核不完全，则导致克隆胚染色体的不完整性，造成卵裂异常，影响克隆胚的发育；如果胞质丢失过多，则不能进行有效的核重新编程。 显微操作去核大致有三种途径实现去核，其一是活性荧光染料（Hoeches33342）定位法，但是对卵母细胞多少有所损伤。其二为盲吸法，这一方法以排出第一极体为标志可以尽快的将核从去核针内排出来提高去核效率。其三为手工去核法，即使用极薄的刀片（微型注射针+黄枪头+刀片）在显微镜下快速的切除有核的一侧，保留无核的细胞质一侧（用于体细胞注核以及胞质补偿，故做一个胚胎需要2个卵母细胞）5 注核注核一般分为透明带下注射和胞质内注射。胞质内注射一般用piezo-actuation（压电陶瓷系统）微注射系统，直接把供体核注入胞质内7。透明带下注射则把整个供核细胞注射至卵周隙，并需要融合3,8。但是，目前也有研究者直接把整个供核细胞注入胞质内，不需要融合而且效果非常好，其囊胚形成率达37%9。他们认为，（1）移入的供核细胞的细胞膜会逐渐在胞质受体中消失；（2）这样做不需要进行融合减少了体外操作时间；（3）这样做不需要进行融合减少了体外操作时间；（4）确保了DNA能完全进入去核的卵母细胞，避免为获得供体核过程中对供体核结构的损坏；因此这样能更有效地支持重组胚的发育。尽管如此，peura等10采用与传统显微操作程序相反的方法，利用去除透明带的绵羊卵母细胞，先融合外来核，然后再去掉卵母细胞核，不仅结果好，而且大大缩短了体外操作时间。Booth等11应用无透明带的猪卵母细胞进行核移植，并且获得了较好的效果。因此，在显微操作方面目前已有许多科研工作者尝试着一些新的方法，这些方法主要是减少操作强度和难度，从而让更多的科研者更易进入这个领域。6 激活许多哺乳动物，它们的排出的卵母细胞都停留在M期直至被精子受精激活或人工诱导激活才完成第二次成熟分裂。在体内排出的卵母细胞停滞在M期是由于持续高水平的成熟（分裂）促进因子（maturation or nrphase promoting factor,MPF）和/或细胞静止因子（cytostatic factor,CSF）所致。MPF的活性是由对Ca2+非常敏感的CSF来维持。升高的Ca破坏了已存在的CSF，从而导致MPF活性降低。MPF水平下降或消失，就会引起卵子活化促使卵母细胞离开M期，完成减数分裂并进行孤雌发育。卵母细胞的激活主要有物理和化学两种方法。6.1物理方法物理激包括机械刺激、温度变化和电激活等，但应用较多的是电刺激法，由于它模拟了精子受精时钙离子瞬时性升高，一般效果比较好。对猪而言一般电刺激参数为DC（直流电）：0.92.1kv/cm,一次脉冲，30100s或1.01.5kv/cm，二次脉冲，60s或1.3kv/cm，三次脉冲，60s。猪卵母细胞的激活从好多文献试验选择DC：1.5kv/cm，二次脉冲60s，间隔3s，在此前后给予一个10v,5s的交流电往往能得到比较好的效果。6.2化学激活化学激活方法则有很多种，注射钙离子缓冲液，用7%乙醇短时间处理或用钙离子载体A2318723处理12。Machaty等（1997）认为Ca的释放依赖于受体复合体上的巯基，用乙基汞硫代水杨酸钠（thimerosal）和二硫苏糖醇（DDT）结合能有效激活猪的卵母细胞。近来，好多学者使用离子霉素（inomycin,Ino）进行激活，因为离子霉素是一种高效的钙离子载体，可动员细胞的Ca释放，并依次触发后期Ca的内流，引起细胞内的Ca升高和卵母细胞的激活。单一使用Ino可以激活卵母细胞，但排出PB2后染色体浓缩，很少形成二倍体的原核，因此，它通常与6-DMAP，CHX或焦磷酸钠（sodium pyropho