（植物学专业论文）微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究.pdf

7 嬲燃螋 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集 保存和使用学位论文的规定 即 学位论文著作权归属苏州大学 本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致 苏州大学有权向国家图书馆 中国社科院文献 信息情报中心 中国科学技术信息研究所 含万方数据电子出版社 中国学术期刊 光盘版 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索 涉密论文口 本学位论文属在 年一月解密后适用本规定 非涉密论文口 论文作者签名 导师签名 一 堑醯 日 巡日 期 坌旦 车生旦g 司 期 丝丝 丝 少 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究中文摘要 中文摘要 微囊藻毒素 m i c r o c y s t i n s m c s 是由淡水藻如微囊藻属 鱼腥藻属 念珠 藻属的一些种类产生的环状七肽肝毒素 该毒素广泛存在于富营养化的水体中 对人们的生产生活造成极大的威胁 近年来 m c s 的生物降解已逐渐成为环境问 题研究的热点 本文以m c s 为唯一碳源 从腐烂蓝藻液中富集得到的混合菌中分离到四菌株 分别编号为s p l s p 2 s p 3 和s p 4 利用添加m c s 作为底物的m 9 培养基测定四 菌株对m c s 的降解能力 发现菌株s p 3 降解能力最高 为3 1 m l d 其次为 s p 2 s p l s p 4 几乎不能降解m c s 从腐烂蓝藻液中富集得到的混合菌对m c s 的 降解能力为3 8m g l d 优于最高效m c s 降解单菌株s p 3 为了确定分离菌株的分类学地位 本文从形态 生理生化 1 6 s r d n a 序列特 征对四菌株进行分析鉴定 基于1 6 s r d n a 采用p a u p 4 o b 4 a 软件 选择最大简约 法 m a x i m u mp a r s i m o n y m p 和最大似然法 m a x i m u ml i k e l i h o o d m l 构建 四菌株系统发育树 结合形态特征和生理生化试验结果将四菌株分别鉴定为 水 生丛毛单胞菌 c o m a m o n a sa q u a t i c a 恶臭假单胞菌 p s e u d o m o n a sp u t i d a 微 嗜酸寡养单胞菌 s t e n o t r o p h o m o n a sa c i d a m i n i p h i l a 藤黄微球菌 m i c r o c c u sl u t e s 将富集得到的混合菌按接种量0 1 o 5 l 5 分别接种至新鲜的蓝藻 原液中 用稀释涂布法测定藻液中的混合菌的生长数量 同时测定藻液中的m c s 含量 结果表明 接种量为1 的混合菌对微囊藻毒素降解效果最好 嗜酸寡养单 胞菌在藻液中的生长数量最多 关键词 微囊藻毒素 水生丛毛单胞菌 恶臭假单胞菌 微嗜酸寡养单胞菌 藤黄微球菌 作者 李现尧 指导教师 史全良 s c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no fm i c r o c y s t i nd e g r a d i n g b a c t e r i aa n dt h e i r d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y a b s t r a c t m i c r o c y s t i n sa r ec y c l i ch e p t a p e p t i d eh e p a t o t o x i n s p r e d o m i n a n t l yp r o d u c e db y f r e s h w a t e rc y a n o b a c t e r i a i n c l u d i n g s p e c i e so fm i c r o c y s t i s a n a b a e n a n o s t o ca n d p l a n k t o t h r i x t h e s et o x i n sa lep r e v a l e n ti nw a t e rb o d i e ss u c ha sr e s e r v o i r sa 1 1 dl a k e s a n dh a v et h ep o t e n t i a lt os e v e r e l yc o m p r o m i s eh u m a n h e a l t h i ns o m ec a s e sr e s u l t i n gi n f a t a l i t i e s i nr e c e n ty e a r s s t u d yo fm i c r o c y s t i n sb i o d e g r a d a t i o ni sb e c o m i n ga h o tp o i n t o fe n v i r o n m e n t a lp r o b l e m f o u rb a c t e r i a ls t r a i n sw e r ee n r i c h e da n di s o l a t e df r o mr o t t e n c y a n o b a c t e r i ao f t a i h ul a k eb yd i l u t i o n p l a t em e t h o d t h es e r i a ln u m b e r so ff o u rs t r a i n sa r es p 1 s p 2 s p 3a n ds p 4i nt h el a b o r a t o r y t h e i rm i c r o c y s t i n sd e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yw a s m e a s u r e d b ym 9m e d i u m a d d e d m i e r o e y s t i n s t h e r e s u l t so f m i c r o c y s t i n s d e g r a d i n g e x p e r i m e n t ss h o wt h a tt h eh i g h e s te f f i c i e n tb a c t e r i u mi s s p 3 t h em i c r o c y s t i n s d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fs p 3i s3 1m e l d t h en e x ti ss p 2 s p 1 s p 4c o u l dh a r d l v d e g r a d em i c r o c y s t i n s t h em i c r o c y s t i n s d e g r a d i n ge f f i c i e n c yo fm i x e db a c t e r i ai s 3 8 m g l d w h i c hi sh i g h e rt h a ns p 3 i no r d e rt oe n s u r et h e i rt a x o n o m i cs t a t u s t h ef o u rs t r a i n s w e r er e s p e c t i v e l y i d e n t i f i e da sc o m a m v n a s a q u a t i c a p s e u d o m o n a sp u t i d a s t e n d t r o p h d 所d h a s j a c i d a m i n i p h i l a m i c r o c c u sl u t e sb a s e do nm o r p h o l o g i c a l p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n d16 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i s t h e i rp h y l o g e n e t i c t r e e sw e r ec o n s t r u c t e d b y p a u p 4 o b 4 a s o f t w a r e u s i n gm a x i m u mp a r s i m o n ya n dm a x i m u ml i k e l i h o o dm e t h o d s t h em i x e db a c t e r i aw e r ev a c c i n a t e dt of r e s hc y a n o b a c t e r i ab yd e f e r e n t i n o c u l a t i n g a m o u n t s t h er e s u l t ss h o wt h a t1 i st h eb e s ti n o c u l a t i n ga m o u n t 誓e y w o r d s m i c r o c y s t i n c o m a m o n a s a q u a t i c a p s e u d o m o n a s p u t i d a s t e n o t r o p h o m o n a sa c i d a m i n i p h i l a m i c r o c c u sl u t e s w r i t t e n b y l ix i a n y a o i l s u p e r v i s e db y s h iq u a n l i a n g 目录 第一章文献综述 1 1 1 微囊藻毒素 1 1 2 微囊藻毒素的提取 3 1 3 微囊藻毒素的检测 3 1 4 微囊藻毒素的去除 4 1 5 微生物降解微囊藻毒素的研究现状 7 1 6 分子生物学方法在细菌分类鉴定中的应用进展 8 1 7 选题的目的和意义 11 1 8 技术路线 1 2 第二章微囊藻毒素降解菌的分离和纯化 1 3 2 1 材料和方法 1 3 2 2 结果与分析 1 7 2 3 小结 2 0 第三章分离菌株的鉴定 2 3 3 1 分离菌株的形态特征观察 2 4 3 2 分离菌株的生理生化特征测定 2 9 3 31 6 s r d n a 序列同源性和系统发育分析 3 7 第四章混合菌对蓝藻原液中微囊藻毒素的降解效应 5 1 4 1 材料与方法 5 1 4 2 结果与分析 5 l 4 3 讨论与结论 5 3 第五章总结与展望 5 4 5 1 总结 5 4 5 2 展望 5 5 5 3 本文以后研究的重点 5 6 参考文献 5 7 硕士研究生期间发表的论文 6 6 致谢 6 7 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究 第一章文献综述 第一章文献综述 随着人类生产 生活方式的迅速发展 工业化 城市化的进程加快 大量含 有丰富氮 磷污染物的工业废水和生活污水排入水体 全国淡水水体富营养化状 态日益严重 涉及范围不断扩大 引起藻类尤其是蓝藻的过度繁殖 爆发水华 从而导致水体内溶解氧的急剧下降 水质恶化 鱼类及其他生物大量死亡 其中 太湖 巢湖 滇池三湖蓝藻问题最严重 对流域内的生态环境 经济发展 居民 正常生活都造成严重影响 我国目前已经成为世界上蓝藻水华最严重 水华种类 最多 分布最广泛的国家之一 水华藻类浮在水面 使水体透明度明显降低 气味变得腥臭难闻 藻类的光 合作用明显受抑制 使溶解氧来源减少 藻类死亡后腐烂分解 也消耗水体的大 量溶解氧 形成富营养水体的恶性循环 正常湖泊水体的生态平衡被扰乱 导致 水生生物的稳定性和多样性降低 另外 水华藻类产生的臭味和有毒的有机物对 饮用水造成威胁 淡水蓝藻包括微囊藻属 鱼腥藻属和颤藻属的一些种类可产生 有毒的物质 微囊藻毒素 卜3 1 1 1 微囊藻毒素 1 1 1 微囊藻毒素的化学结构 微囊藻毒素 m i c r o c y s t i n s m c s 是由水体中蓝藻类产生的单环七肽化合物 见 图1 1 4 a d d a 3 氨基 9 甲氧基 2 6 8 q j 基 1 0 苯基 4 6 二烯酸 为一特殊 的2 0 个碳原子的p 氨基酸 它是表达m c s 活性的必需基团 其结构改变或被去除 毒素的毒性就会降低 m c s 的第2 位和第4 位的氨基酸残基可变 m c 根据代表其第 2 位和第4 位的氨基酸残基的大写字母来命名 目前发现的m c s 同系物已经超过7 0 种 包括m c l r m c r r m c l w m c y r 等 其中最普遍 研究最多的是 m c l r 5 1 m c s 是一类肽毒素 主要的靶器官是肝脏 7 1 m c s 能强烈抑制蛋白磷酸 酯酶的活性 导致细胞内多种蛋白质的过度磷酸化 使细胞内的蛋白磷酸化和去 磷酸化作用调节失衡 改变了多种酶的活性 造成细胞内一系列的生理生化反应 紊乱 随即发生一系列的生理病理变化 6 1 1 9 9 6 年在巴西c a r u a r u 市一所透析医院 第一章文献综述微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究 的肾透析治疗中 由于误用m c s 污染水作为肾透析用水 结果导致1 1 6 人中毒 5 2 人死亡 8 1 在海宁市进行的流行病学研究发现大肠癌发病率与当地浅表水源的m c s 含量存在正相关 9 1 直接接触含有m c s 的水体可引起皮肤和眼睛过敏 发烧 疲劳 以及急性肠胃炎 10 1 世界卫生组织 w h o 推荐饮用水中的m c s 浓度不高于 l u g l t l1 1 1 3 d 畀天冬氨峨 注 r 1 r 2 r 3 代表h 或者c h 3 图1 1m c s 的一般结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo fm c s 1 1 2 微囊藻毒素的理化性质 m c s 具有相当的稳定性 在一般的物理化学环境条件下降解十分缓慢 1 2 m c s 溶于水 在水中的溶解度达1 9 l 以上 不易沉淀或被吸附于沉淀物和悬浮颗粒物中 m c s 在水体中的稳定时间与水体的特征有关 m c s 在去离子水中可保持稳定状态长 达2 7 天 在消毒的水库中可保持稳定1 2 天 在自然水库中7 天以内即会通过a d d a 旁链的修饰灭活从而发生生物降解 m c s 可被紫外线光解或发生化学异构和化学 键合反应而丧失毒性 其半衰期是1 0 天 m c s 具有热稳定性 在加热煮沸 水浴 1 0 0 c 3 0 m i n 不致丧失毒性 1 3 m c s 虽然是多肽 但是一般的蛋白酶并不能将 其水解 传统的水处理工艺的混凝 沉淀 过滤 加氯等均不能有效去除m c s l l 4 2 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究第一章文献综述 1 2 微囊藻毒素的提取 m c s 是胞内毒素 破碎微囊藻细胞的方法主要有 超声波破碎 多次冻融 冷冻干燥 沸水浴和微波法 l5 1 抽提的溶剂主要有丁醇 甲醇 水 5 的乙酸 5 0 8 0 的甲醇 去离子水 1 q 等 浓缩净化的方法主要有调节p h 值 抽滤 固相 萃取 旋转蒸发和氮气吹干法 1 7 1 等 纯化分离主要是应用c 1 8 等不同类型的分离柱 在h p l c 上根据m c s 紫外吸收峰收取对应的流动相 17 1 1 3 微囊藻毒素的检测 m c s 的检测方法主要分为生物检测法 化学检测法和生化检测法 应用最普 遍的是高效液相色谱法 h p l c 和酶联免疫吸附分析法 e l i s a 1 3 1 生物检测法 最传统的检测有毒物质的方法 最常用的生物实验对象是小白鼠 采用小白 鼠腹腔注射或口腔灌喂 带小鼠死亡后检查肝肾等器官的损伤情况 以杀死半数 实验小鼠的毒素剂量l d 5 0 毒素干重 d 鼠体重 单位为m g k g 或者小鼠死亡时间 来评价m c s 的毒性 也有学者用蝗虫 盐虾 1 8 和细菌 1 9 1 作为指示生物 细胞毒性 检测技术 2 0 利用毒素对细胞的毒性作用对毒素进行检测 可以对毒素进行定性和 定量测定 1 3 2 化学检测法 包括薄层色谱 t l c 气相色谱 g c 高效液相色谱 h p l c 高效液相色 谱和质谱 h p l c m s 气相色谱和质谱 g c m s 联用 毛细管电泳 c e 等方法 在化学检测方法中使用较多的是h p l c 2 1 2 4 h p l c 技术多采用反相c 1 8 柱 流动相 选用甲醇 乙腈等对毒素进行分离 然后进行紫外 u v 荧光 f l 或化学发光 c l 检测 通过与标准的出峰时间进行比较而对毒素种类进行定性鉴定 并用峰 面积比较法对毒素进行定量分析 h p l c 技术可广泛用于m c s 的分离 鉴定和定量 检测 1 3 3 生化检测法 主要包括酶联免疫测定法 e l i s a 和蛋白磷酸酶抑制测定法 p p i a 酶 联免疫测定法灵敏 简便 快速 设备依赖性低 常用于检测样品中的m c s 2 5 之8 1 水质免疫检测普遍使用的方法是竞争性非匀相酶联免疫 常用的商品化e l i s a 试剂 第一章文献综述微囊藻毒索降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究 盒就是利用m c l r 与辣根氧化酶的直接竞争性e l i s a 方法 蛋白磷酸酶抑制分析 法 2 9 3 0 1 通过m c s 对蛋白磷酸酶的酶活力的抑制程度来检测m c s 的含量 常用m c s 检测技术的优缺点见表1 1 3 l 表1 1m c s 检测技术的优缺点对比 t a b l el l c o m p a r i s o no f a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so f a n a l y t i c a lm e t h o d sf o rm c s 1 4 微囊藻毒素的去除 q 1 4 1 物理方法 1 吸附和过滤 传统的水处理工艺中多使用石英砂作为滤料 对过滤m c s 效果不理想 l a m b e r t 等 3 2 利用砂石 煤双层滤料过滤与明矾混凝沉淀处理水中的m c s 去除率可以达到 5 0 6 0 而采用表面有细小纹理颗粒的高粘度粘土矿石 如高岭土等 作为滤料 过滤m c s 去除率能达至1 j 8 1 3 3 实颗粒活性炭 o a c f l 邑在一定程度上过滤m c s 而粉末活性炭 p a c 也能够去除m c s 3 4 3 5 但是魏军艳等实验发现粉末活性炭单独 使用时对m c l r 进行吸附去除的效果并不好 在反应时间3 0 m i n p h6 6 温度2 5 c 的条件下 1 0 m g l 的投加量去除率只有1 4 左右 3 6 l 尽管活性炭可以吸附水体中 的m c s 自然水体中的有机物会与极性较弱的藻毒素竞争吸附位点 从而降低活 4 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究第一章文献综述 性炭对m c s 的去除效果 为了要去除m c r r 和m c l r p a c 的投加量甚至可以高 达8 0 0 m g l 一般p a c 添加范围1 1 0 0 m g l 1 3 7 用此种方法进行藻毒素的处理成本 高昂 不适合大规模的使用 2 膜技术 膜技术使用的膜是一种具有特殊选择性分离功能的无机或高分子材料 它能 把流体分隔成不相通的两个部分 使其中的一种或几种物质能透过 而将其他物 质分离出来 膜技术主要分为微滤法 超滤法 纳滤法和反渗透法 反渗透 r o 技术是利用反渗透膜只能透过溶剂 通常是水 而截留离子物质或小分子物质的 选择透过性 以膜两侧静压为推动力 而实现的对液体混合物分离的膜过程 现 在反渗透技术已成为现代工业中首选的水处理技术 m c s 的相对分子量在1 0 0 0 左 右 所以利用r o 技术来处理m c s 是可行的 超滤法 纳滤法和反渗透法对水中m c s 的去除效果较好 其中 超滤法的去除效果可达9 8 反渗透则可达9 9 6 t 3 3 j 因 此 采用膜技术可基本去除水中的m c s 许多欧美国家已经将膜滤技术应用于 1 0 0 0 0m 3 付以上的水处理厂1 3 9 1 但是 从处理工艺运行的经济性以及滤膜的高损耗 带来的高成本来考虑 反渗透和膜过滤技术还是很难应用于发展中国家的大型污 水处理厂 以上物理方法均对m c s 有不同程度的去除作用 但通常不能彻底地去除细胞 外的毒素 必须进行预处理或深度处理 且运行成本较高 难以大规模地推广 1 4 2 化学方法 1 氧化剂氧化 常用的氧化剂有氯化剂 高锰酸钾 臭氧等 高锰酸钾是一种强氧化剂 它 可以通过破坏多肽的环状结构来去除m c s 赵建伟等f 删采用液相色谱串联质谱 h p l c m s 的检测方法研究高锰酸钾对m c l r 降解作用 发现随着高锰酸钾投加 量的增大 m c l r 的去除率不断升高 当高锰酸钾投加量为0 8 m g l 时 反应2 0 m i n 后 m c l r 的去除率8 0 以上 l a m 掣4 1 采用6 种化学试剂处理m c l r k m n 0 4 c 1 2 可使藻细胞裂解 反而导致m c l r 浓度增加 因此利用氯化剂 高锰酸钾去除 m c s 时 氧化剂要达到一定的浓度 如果投放剂量过少 非但不能有效去除m c s 反而会因藻细胞的破裂而导致水体中m c s 浓度的升高 但投放剂量过大 则会造 成二次污染 余国忠等 4 2 发现 2 m g l 的臭氧可去除8 0 原水中的m c s 而8 m g l 的臭氧去除率在9 0 左右 同时去除毒素的效果受毒素浓度及臭氧浓度 作用时 5 第一章文献综述微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究 间等因素的影响 需要保持水中有一定量的臭氧残留 才能有较好的效果 利用 臭氧的强氧化作用去除藻毒效果好 产生的有害毒副产物少 不会导致藻细胞裂 解 但处理成本比较高 操作较困难 很难广泛应用1 4 引 2 光催化氧化 m c s 可被紫外线光解或发生化学异构和化学键合反应而丧失毒性 因此在光 照充足时 m c s 可发生缓慢的光降解或异构化 m c s 的降解率与光线强度有关 p h 值对其降解有重要作用 中性和酸性环境有利于m c r r 的降解 紫外线对 m c r r 的降解率随温度升高而升高 4 5 程子波等 4 6 1 研究叶绿素在m c l r 光催化降 解中的作用 发现叶绿素能导致m c l r 在日光照射下降解 并且m c l r 的降解与 叶绿素的浓度呈正相关 纳米级t i 0 2 在紫外光照射下发生连锁反应生成羟基自由 基 o h 等各类高活性氧化基团 可显著破坏m c s 分子结构中的支链a d d a 因 而可有效降低甚至完全消除其生物毒性 4 7 1 可以看出 光催化氧化技术降解m c s 是一种很有前途的方法 但学者们在光能利用方面大多采用紫外光源 消耗大量 能源 更会对水体中其他生物和植物造成严重损伤 4 8 1 同时经处理后的水体含有 大量分解的有害物质 对水体造成二次危害 1 4 3 生物降解 1 水生生物降解 张玮等 4 9 研究了在不同处理时间和不同初始m o s 浓度下 浮萍的生长 光合 生理特性以及对m c s 的去除效果 结果表明 当m c r r 的浓度不超过9 6 0 g l 时 浮萍能够在短时间内有效去除水体中m c s p f l u g m a c h e rs 和y i nl 发现挺水植物芦 苇 5 0 1 沉水植物枯草 5 1 也能吸收代谢一定浓度的藻毒素 水体中的一些浮游动物 和鱼类对m c s 也具有耐受和降解能力 g u o 等1 5 2 报道在微囊藻存在的情况下 可以 使得耐毒能力提升快的小型枝角类取代以大型枝角类转变为为优势种 像鲢鱼 罗非鱼等对m c s 的耐受性较强 并可吞食 消化藻类 在中国和一些欧美国家 鲢鱼被利用作为控制藻类水华 以达到延缓水体富营养化的一项生物防治措施 5 3 1 2 人工湿地系统降解 人工湿地作为一种高生产力的新型污水处理系统 通过湿地中基质 植物和 微生物相互关联 物理 化学和生物学过程协同作用净化污水 对于处理城镇生 活污水中的氮 磷等营养元素及细菌 藻类有良好的效果 湿地中的沙石基质具 有类似于活性炭的吸附作用 植物根区附近形成的生物膜有絮凝作用 湿地中丰 6 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究第一章文献综述 富的微生物可将藻毒素降解 5 4 1 宋海亮等 5 5 利用水生植物滤床系统在太湖湖滨进 行了中试研究 结果表明 总藻毒素平均去除率达到5 9 4 3 微生物降解 微生物去除m c s 具有成本低 安全性强和利于生态修复等优点 是一种去除 m c s 很有前途的方法 5 6 1 微生物可以编码一些特殊的酶来催化降解m c s 一般认 为多肽类的化合物是按照多肽 二肽 氨基酸和氨的规律进行1 5 7 1 国内外对混合 菌 纯菌株对m c s 以及微生物对m c s 的降解机理进行了大量相关的研究 取得了一 定的进展 1 5 微生物降解微囊藻毒素的研究现状 1 5 1 混合菌对m c s 的降解与转化 m i l l e r 等 5 8 研究发现有机碳和粘土含量高的土壤比砂质土壤更容易吸附和降 解m c s c o u s i n s 等 5 9 j 利用水库中的自然菌群降解m c l r 一周内藻毒素浓度开始 降低 但是降解速度很慢 c h r i s t o f e r s e n 等 6 0 发现8 天内湖泊中的微生物菌群可将 0 1 m g l 的m c s 全部降解 l a m 等 6 l 报道污水处理场的混合菌需要2 5 天才能将 0 2 5 m g l 的m c l r 完全降解 吕锡武等 6 2 采用批式生物膜研究了污泥中的微生物 对m c l r m c r r m c y r 的生物降解 结果表明混合菌对m c s 的降解能力并不 高 金丽娜等f 6 3 等利用从滇池蓝藻水华生物量中提取的m c s 试验溶液 接种滇池 沉积物的微生物 藻毒素的生物降解速度随反应温度和沉积物量的增加而提高 混合菌对m c s 有一定的降解能力 但是从自然环境中选取的混合菌群对m c s 总体降 解能力并不理想 1 5 2 纯菌株对m c s 的降解与转化 j o n e s 等脚1 于1 9 9 4 年最先从澳大利亚水体中筛选出一株能够降解m c s 的鞘氨醇 单胞菌 定名为m j p v s h i g e y u k i 等 6 5 从日本湖泊表层水中分离到一株铜绿假单 胞菌在5 0 m g l 的m c l r 浓度下 2 0 天后去除率达9 0 以上 p a r k 等 6 6 从富营养化 的水体中分离到一株可以降解m c l r m c r r m c y r 的菌株y 2 经1 6 s r d n a 序列分析属于鞘氨醇单胞菌 此菌株最高降解m c r r 和m c l r 效率分别为1 3 和 5 4 m g l d s a i t o 等 6 7 在日本k a s u m i g a u r a 湖中分离到一株能够降解m c l r m c r r m c y r 的细菌 m d 1 经1 6 sr r n a 序列鉴定为鞘氨醇单胞菌 i s h i i 等 6 8 从日本s u w a 湖表层水中分离到鞘氨醇单胞菌属的革兰氏阴性好氧菌7 c y 可以在4 天内将浓度为6 m g l 的m c l r m c l y m c l w m c l f 降解完全 v a l e r i a 等 7 第一章文献综述微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究 6 9 j 从s a nr o q u e 水库中筛选到一株能够降解m c i 氓的好氧菌株c b a 4 基于 1 6 s r d n a 序列将此菌株鉴定为鞘氨醇单胞菌属 此菌株可在3 6 d 时内将2 0 0 u 虮的 m c r r 完全降解 h o w l 7 0 从生物沙滤池中分离到一株印砌傍叩垮括属的菌株l h 2 l 此菌株可在5 小时内完全降解1 0 u g l 的m c l r 和m c l a 2 0 0 8 年 l e m e s 等 7 1 1 在巴 西p a r o s 湖口分离到一株m c l r 降解菌 经1 6 s r d n a 序列鉴定为伯克氏菌属 我国 学者闰海等 7 2 率先从滇池底泥中筛选出一株m c s 降解菌 经中科院微生物所鉴定 为青枯菌 对m c l r 和m c r r 的降解速率分别为9 4 和1 6 7 m e c l 刘海燕等1 7 3 从发 生水华的水体中筛选到一株m c l r 高效降解菌 通过1 6 sr d n a 进行同源比较 鉴 定该菌株为芽孢杆菌属 周洁 7 4 从云南滇池底泥中筛选了一株能够降解m c s 的微 生物纯菌种 经中国科学院微生物研究所鉴定为食酸戴尔福特菌u s t b 0 4 该菌能 在2 天时间内将初始浓度分别为9 0 2m e d l 和3 9 6 m g l 的m c r r 和l r 全部降解 日 均降解能力分别达至1 j 4 5 1 m g l 和1 9 8 m e d l 国内外已报道的m c s 降解纯菌株有鞘氨醇单胞菌 6 4 1 铜绿假单胞菌属 6 5 1 伯 克氏菌 7 1 1 青枯菌 7 2 1 芽孢杆菌 7 3 1 食酸戴尔福特菌 7 4 1 其中 多数菌种为鞘氨 醇单胞茵属 由于上述菌株降解试验的m c s 种类 培养基 接种量和培养条件不 尽相同 因此不能仅仅根据文献所列的数据来比较上述菌种的降解能力 虽然国 内外在分离纯化可降解m c s 降解菌方面取得了一定进展 但是报道的纯菌株的数 量和种类还是有限 另外 大规模应用降解菌治理m c s 污染还未见报道 这说明 分离纯化m c s 降解菌的工作还停留在研究阶段 1 6 分子生物学方法在细菌分类鉴定中的应用进展 细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类 分成4 个水 平 细菌形态和生理生化水平 细胞组分水平 蛋白质水平和核酸水平 表型鉴 定法是对前3 个水平的鉴定 包括常规鉴定法 数值分类鉴定法和化学分类鉴定法 分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定 对细菌染色体或质粒d n a 进行分析 此类 方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定 7 5 细菌形态和生理生化水平是最经典 最常用的分类鉴定指标 也是现代化分 类鉴定的依据 但是传统的鉴定方法主要是对细菌进行纯培养 从形态学 生理 生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定 大量菌种的分类鉴定是一项繁琐 费时的工作 并且常规鉴定法常出现表型表达不稳定 敏感性不高 测试项目多 费时费力等问题 免疫诊断技术若无相应抗体则无法鉴定 细菌自动化鉴定适于快 8 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究第一章文献综述 速鉴定 但目前数据库中模式菌种数量有限 部分细菌只能鉴定至属 对革兰氏 阳性菌和厌氧菌的鉴定效果较差 因此迫切需要建立一种简单 方便 易于操作 的分类鉴定方法 使人们在一定程度上更加科学 精确 快速地找到微生物的分 类地位 为微生物资源的开发利用奠定基础 2 0 世纪6 0 年代开始 分子遗传学和 分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代 许多新技术和 方法如g c m 0 1 含量测定 核酸杂交 p c r 技术 1 6 sr r n a 和1 6 2 3 sr r n a 序列 分析等在细菌分类学中得到广泛应用 7 6 1 6 1 染色体d n ag c m 0 1 含量测定 细菌染色体d n ag c m 0 1 含量非常稳定 不受菌龄和环境因素影响 对表型 相似的疑难菌株鉴定 新的分类单位建立和细菌亲源关系判定等是一项重要的分 类鉴定指标和参考标准 测定细菌染色体d n ag c m 0 1 含量的常见方法有高效液 相色谱法 7 7 热变性温度法 7 8 荧光法和纸层析法等 1 6 2 核酸杂交及基因芯片技术 具有同源序列的两条d n a 单链或d n a 与r n a 单链在适当的条件下能互补地 形成稳定的d n a 双链或d n a r n a 链 随着s o u t h e r n 印迹技术的出现 用标记的带 有高度特异性d n a 限制性同源基因位点的d n a 探针可识别具有同源序列的限制性 片段 从而降低片段长度多态性所要分析的条带数量 所有携带与探针一样的同 源基因位点的细菌菌株都可得到分离 结果具有很高的重复性 7 9 1 基因芯片又称d n a 芯片或c d n a 微矩阵 是指固着在载体上的高密度d n a 微 点阵 根据核酸的分子杂交衍生而来 即应用已知序列的核酸探针对未知序列的 核酸序列进行杂交检测 8 0 8 h 基因芯片技术快速 准确 具有高通量 自动化 微型化的特点 在微生物检测和鉴定方面的应用越来越多 具有巨大的应用潜 力 8 2 1 6 31 6 s r d n a 序列 r r n a 基因序列为细胞所共有 功能同源且最为古老 既含有保守序列又含可 变序列 分子大小适合操作 序列变化与进化距离相适应 8 3 素有 细菌化石 之 称 原核生物的r r n a 有3 个类型 2 3 sr r n a 1 6 sr r n a 5 sr r n a 分别有 2 9 0 0 1 5 4 0 和1 2 0 个碱基 5 sr r n a 虽然容易分析 但是核苷酸太少 没有足够 信息用于分类研究 2 3 sr r n a 碱基数量几乎是1 6 sr r n a 的两倍 分析工作量大 经过大量研究证明 1 6 sr r n a 片段长度适中 信息量较大易于分析 8 5 是细菌种 9 第一章文献综述 微囊藻毒索降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究 属鉴定的分子基础 传统细菌分类方法必须以菌株纯培养为前提 然而自然环境 中能够纯培养的微生物菌株数量还不足自然界微生物总数的1 而16 sr d n a 序 列同源性分析既适于细菌属种的分类鉴定 又不受菌株的纯培养物条件的限制 且简单 快捷 准确 能够很好的弥补传统细菌分类方法的弊端 现已成为国际 细菌种属鉴定和分类的标准方法 系统发育分析 就是根据能反映微生物亲缘关 系的生物大分子的序列同源性 计算不同物种之间的遗传距离 然后采用聚类分 析等方法将微生物进行分类 并将结果用系统发育树 p h y l o g e n t i ct r e e 表示 构 建系统发育树的方法有临接法 n e i g h b o rj o i n n j 最大简约法 m a x i m u m p a r s i m o n y m p 和最大似然法 m a x i m u ml i k e l i h o o d m l 构建系统发育树常 用到的软件有p a u p 8 6 8 7 1 c l u s t a l t 8 8 1 等 1 6 41 6 s 2 3 sr d n a 间隔区序列 1 6 s 2 3 sr d n a 间序列 i n t e r g e n i cs p a c e rr e g i o n s i s r 由于1 6 sr r n a 基因 进化速度非常慢 即太保守 只能在 种 s p e c i e s 水平上对细菌加以区分鉴别 而 无法区分某些种系非常接近的菌种及同一菌种的不同菌株 而i s r 序列的进化速 度是1 6 sr r n a 基因的1 0 倍 长度和碱基序列相比于1 6 sr d n a 具有更强的特异 性 同一菌种不同菌株的i s r 是不同的 因此i s r 可用于菌株的鉴别 8 9 母0 1 是1 6 s r r n a 基因分析很好的补充 1 6 5 限制性片段长度性 r f l p 分析 r f l p r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 是指基因型之间限制性片段 长度的差异 这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入 缺失 重排或点突变 所引起的 r f l p 利用限制性内切酶特性及其电泳技术 对特定的d n a 片段的限制 性内切酶产物进行分析 根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量评价群落 种类和多样性1 9 r f l p 可以对大量的样品进行有效的分析 同时 对线粒体分子 的分析对种内和种间的分类会更灵敏 此外 核糖体的分析也已应用于真菌种间 和种下的亲缘关系 9 2 1 1 6 6 随机扩增d n a 多态 t 生 r a p d 分析 r a p d r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a 是由w i l l i a m s 和w e l s h 在19 9 0 年 各自独立发现的一种d n a 多态检测技术 适用于细菌种问 亚种间以至株间的亲 缘关系的鉴定 r a p d 技术基于p c r 的d n a 多态性分析方法 以非限制性的随机寡 核苷酸链为引物 通常是由1 0 个随机排列的寡核昔酸构成一条随机引物链 非特 1 0 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究第一章文献综述 异性引物可以结合在模板d n a 的多个位点 产生多个p c r 产物 每个菌株在每条 引物扩增后产生的图谱合称为针对一菌株的单一图谱 再通过软件分析 目前已 广泛应用于系统发育研究 动植物种类鉴定 基因图谱构建 种群的遗传分析 人类基因组研究等领域 9 3 j 1 6 7 扩增片段长度多态 i 生 a f l p 分析 a f l p a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 技术是由荷兰的z a b e a u 发现 是一种检测d n a 多态性的新方法 生物基因组d n a 经限制性内切酶双酶切后 形 成分子量大小不等的随机限制性片段 将特定双链接头连接在这些d n a 片段的两 端 形成一个带接头的特异片段 作为d n a 扩增的模板 接头序列以及与其相连 的限制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物结合位点 p c r 引物3 末端含有 选择核苷酸 选择核苷酸延伸到酶切片段区 这样就只有那些两端序列能与选择 核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增 扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离检测 a f l p 所产生的多态性远远超过了r f l p r a p d 等 目前被认为是d n a 指 纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术 目前 该技术在微生物的分类鉴定与 遗传多样性的研究上得到了广泛的应用 9 4 1 分子生物学方法从本质上鉴定细菌间的亲缘关系 专业性强 在细菌分类研 究中扮演者越来越重要的角色 其中1 6 sr d n a 序列分析正适用于细菌属和种的分 类鉴定 并且准确 简单 快捷 已经成为细菌分类鉴定的标准方法 i s r 序列分 析 r f l p r a p d a f l p 等方法适用于细菌种间 亚种间以至株间的亲缘关系的 鉴定 但试验条件要求高 如需要对细菌进一步分类 可考虑使用 1 7 选题的目的和意义 m c s 释放到水体中 对人们生产生活用水造成了极大的威胁 用物理化学方 法去除m c s 耗费大量人力物力 并且只能治标不能治本甚至还可能对水体造成二 次污染 在自然条件下 水体中m c s 的降解主要是生物降解和光降解 在富营养 化水体中 发生水华的水体透明度通常很低 水体下层及沉积物中的m c s 降解则 主要是通过生物降解起作用 因此生物降解是影响m c s 在水环境中残留的重要因 素 了解微生物对m c s 的生物降解过程不仅有利于了解其环境归趋 评价其毒理 学效应 而且对于有目的地利用生物降解手段控制和治理水体m c s 污染都具有显 著的意义f 9 5 目前 生物降解微囊毒素是一种最安全有效的方法1 9 6 1 m c s 结构稳定 但它可以被一些微生物产生的特殊的酶催化降解 在水华频 第一章文献综述微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及其降解效能研究 繁发生的环境中 像池塘 水库 湖泊表层水 湖底沉积物等有着很多被m c s 孕l i 化的能够降解m c s 的微生物 将筛选出的高效降解菌投放到爆发水华的水体中 降解菌可以利用藻细胞裂解释放的碳源和氮源快速生长 并且降解水体中的m c s 达到修复和改善水环境m c s 污染的目的 另外 水华藻类是一笔宝贵的资源 水 华藻类含有丰富的蛋白质 脂肪酸 多糖可以做肥料 但是其中的m c s 无疑是制 约水华利用的一个瓶颈 将高效的藻毒素降解菌降解m c s 可为水华藻资源化铺平 道路 有效菌种的研究多数停留在实验室阶段 这种情况之下菌种对天然水体的适 用性 实用性 以及对天然生态系统的安全性也需要进行实验和研究 自然环境 中 对m c s 有降解作用的肯定不是单一菌种 而是一个复杂的生态系统中共存的 几种细菌或各种特定条件共同作用的结果 因此研究和筛选混合菌种或复合菌种 可能是大面积利用细菌降解m c s 的突破口 1 8 技术路线 1 2 微囊藻毒素降解菌的筛选鉴定及j 降解效能研究 第二章微囊藻毒素降解菌的分离和纯化 第二章微囊藻毒素降解茵的分离和纯化 在自然环境中 水体中的m c s 的降解方式主要有两种 光降解和微生物降解 光照充足时 水体中的m c s 可在紫外线的作用下缓慢降解 但要有水溶性色素和 腐殖质等光敏剂的参与才能有效的降解 富营养化的水体透明度较低 特别是水 华爆发时 光线很难达到水体深处 因此水体深处和沉积物中的m c s 主要通过微 生物来降解 在发生水华的水体中 微生物可以逐步改变自身的特性来适应m c s 的环境 进行自行驯化并发生遗传变异 因此 在m c s 大量存在的环境中可能存 在微囊杂毒素降解菌 本章从宜兴新庄街道太湖蓝藻打捞点的蓝藻堆积池中的腐 烂蓝藻液中富集分离到m c s 降解菌 并对筛选菌株的m c s 的降解能力进行了测定 2 1 材料和方法 2 1 1 腐烂蓝藻液 从太湖中打捞的蓝藻细胞浓度高 蓝藻腐烂后 大量释放m c s 使其中的m c s 浓度迅速升高 高浓度的m c s 有利于驯化出m c s 降解菌 故本实验采用腐烂的蓝 藻作为m c s 的筛选材料 采集宜兴新庄街道太湖蓝藻打捞点的蓝藻堆积池中的腐 烂蓝藻 4 保存 2 1 2 培养基 1 m 9 培养基 n a 2 p 0 4 7 h 2 01 2 9