生化分离整理思考题.doc

1、全球十大生物技术公司：全球生物技术公司的领头羊-安进公司(Amgen)Biogen Idex(美国)；吉利德迷信（美国）；健赞（美国）；Celgene(美国)；Kyowa Hakko Kirin（日本）；Vertex(美)；生命科技（美）；CSL(澳大利亚)；Amylin(美)2、生物分离过程的一般流程？ 答：（1）若目标产物存在于细胞外，将细胞与培养液分离，对上清液粗分离、纯化、脱盐、浓缩、结晶干燥处理后得到成品。（2）若目标产物存在于细胞内，将细胞与培养液分离开来，利用细胞破碎等方法将目标产物释放到液相中，除去细胞碎片后进行一系列粗分离和纯化操作，脱盐、浓缩、结晶干燥处理后得到成品。（3）若胞内目标产物是以包含体形式存在的蛋白质，将细胞与培养液分离开来，利用细胞破碎等方法将目标产物释放到液相中，除去细胞碎片后，利用盐酸胍等变性剂溶解包含体，然后进行蛋白质的体外折叠复性，获得具有活性的目标蛋白质，再经过粗分离、纯化、脱盐、浓缩、结晶干燥处理后得到成品。4、不同生物物质分离提取常用的单元操作？答：菌体：离心过滤、离心沉降、微滤；细胞碎片：离心过滤、离心沉降、泡沫分离细胞：离心沉降、泡沫分离、微滤；血球：离心沉降蛋白质：超离心、泡沫分离、超滤、透析、双水相萃取、反胶团萃取、反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水性色谱、色谱聚焦、凝胶电泳、等电点聚焦、等速电泳、二维电泳、色谱电泳、溶液结晶、盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀核酸：超离心、双水相萃取、反胶团萃取、离子交换色谱、亲和色谱、疏水性色谱、凝胶电泳、色谱电泳、盐析沉淀、有机溶剂沉淀糖类：超离心、反渗透、色谱电泳、超滤（用于多糖）抗生素：超滤、有机溶剂萃取、双水相萃取、液膜萃取、离子交换色谱、溶液结晶水：反渗透、电渗析盐：反渗透、透析、电渗析氨基酸：反渗透、电渗析、有机溶剂萃取、液膜萃取、反胶团萃取、离子交换色谱、等电点聚焦、等速电泳、溶液结晶、等电点沉淀有机酸：电渗析、有机溶剂萃取、液膜萃取、离子交换色谱、溶液结晶香料：超临界流体萃取脂质：超临界流体萃取、反相色谱生物碱：超临界流体萃取甾醇类：反相色谱乙醇：渗透汽化维生素：反相色谱尿素：透析1. 工业常用吸附剂类型？可吸附的组分？活性炭：憎水性，脱色、脱臭、废气处理。多孔树脂：聚苯乙烯，聚丙烯酸树脂。硅胶、氧化铝等吸附剂：除水。分子筛：筛分作用，除水，混合物分离。 生物大分子层析专用：多孔性纤维素，琼脂糖凝 胶，葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶和羟基磷灰石。2. 离子交换树脂的分类、命名和性能。离子交换树脂以官能团的性质分类分为强酸、弱酸、强碱、弱碱、螯合、两性及氧化还原树脂（又称电子交换树脂） 性能评价：交换容量：单位质量的离子交换剂（mmol/g干树脂，或mmol/ml湿树脂）所吸附的一价离子的物质的量，是表征离子交换能力的主要参数3.6-4.5mmol/g干树脂。交联度：与孔隙、机械强度有关。树脂基体聚合时所用二乙烯苯的百分数，对树脂的性质有很大影响。通常，交联度高的树脂聚合得比较紧密，坚牢而耐用，密度较高，内部空隙较少，对离子的选择性较强；而交联度低的树脂孔隙较大，脱色能力较强，反应速度较快，但在工作时的膨胀性较大，机械强度稍低，比较脆而易碎。 工业应用的离子树脂的交联度一般不低于4%；用于脱色的树脂的交联度一般不高于8% 溶胀度：转型时某些树脂体积变化大，10-20（Na+H+），近70弱丙烯酸系。密度：真密度：干真密度和湿真密度（阳1.2-1.3，阴1.0-1.1） 视密度（堆积密度）：干视密度和湿视密度（阳：0.75-0.9，阴0.6-0.75）pH范围：弱酸：5-14；弱碱：1-9。3. 离子交换树脂的预处理方法。1. 层析法分类（1）凝胶过滤层析法（Gel filtration chromatography, GFC）凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，是利用凝胶过滤介质为固定相，根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相层析法。不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离。 GFC可分离洗脱体积介于V0和Vt之间的溶质，分离精度有限，料液的处理量也很小。（2）离子交换层析ion exchange chromatography;IEC）固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱。（3）疏水性作用层析（Hydrophobic interaction chromatography, HIC）琼脂糖上连接弱疏水性基团，如：苯基、短链烷烃（C3-C8）、烷胺基、聚乙二醇和聚醚。根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子的分离。蛋白质的疏水性氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸等。根据蛋白质盐析沉淀原理，在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，裸露出疏水部位，疏水性相互作用增大，因此HIC与IEC不同，蛋白质的吸附（进料）需在高浓度盐溶液中进行，洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或阶段洗脱法，需适宜的配基修饰密度。2. 按机理分类，各分离机理、洗脱方法。离子交换层析洗脱方法：阶段洗脱法，分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。 阶梯洗脱：0.2mol/L、 0.5mol/L连续梯度洗脱 ：洗脱剂的pH或离子强度成梯度连续变化。 梯度混合器（1）连续梯度洗脱法： 优点：流动相离子强度连续增加，不出现干扰峰，操作范围广。 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。（2）阶段洗脱法： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊设备，操作简单。 缺点：易出现干扰峰，易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作的参数（如盐浓度，体积）的设计较困难。反相层析：洗脱时，采用降低极性的方法，如：逐渐增加有机溶剂：甲醇或乙醇等浓度的方法。在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。反相层析机理普遍被接受的是Horvath于1976年提出的疏溶剂理论，假设反相层析介质是表面均匀密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固定相之间不存在其他任何相互作用正相层析法：固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。洗脱时采用增加极性的方法。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，恰好与反相法相反，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。层析聚焦：原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡，然后用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液pH呈梯度下降。吸附层析：各组份在吸附剂表面吸附能力不同，固定相是固体吸附剂。洗脱时，通常利用磷酸盐缓冲溶液，采用高盐浓度的线性梯度洗脱法，HAP价格便宜，适用于大规模分离纯化。超临界流体层析：SFC常采用增大压力的压力梯度洗脱法，此外也可与其他溶剂混合使用，改变溶剂（极性）降低极性的浓度梯度洗脱法。由于超临界流体的溶解能力随压力升高而增大，即压力升高，溶质在固定相上的分配系数降低，所以采用增大压力的压力梯度洗脱法。色谱分离度：相邻两组份色谱峰保留值之差与两个组份色谱峰低宽度总和之半的比值。分离度（R）的计算公式为：R2t(R2)-t(R1) / (W1W2 )式中，t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰底宽。反相层析（Reverse phase chromatography, RPC）流动相的极性大于固定相的层析技术。分子在此系统中的移动速度依其极性排列，极性大者移动快。梯度洗脱：在气相色谱中，为了改善对宽沸程样品的分离和缩短分析周期，广泛采用程序升温的方法。而在液相色谱中则采用梯度洗脱的方法。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适