生物传感与DNA阵列.doc

生物传感与DNA阵列生物传感器（biosensors）是生物分析化学的一个重要领域，它结合了生命科学、分析化学、物理学和信息科学及其相关技术，能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪。生物传感器的基本原理生物传感器结构与原理待分析物生物功能膜分子识别引起的物理或化学量的变化换能器可测电信号图8.1 生物传感器的原理生物功能膜，又称生物敏感膜（biosensitive membrane）或分子识别元件（molecular recognition element），是生物传感器的核心器件，直接影响传感器的功能和质量。换能器的作用是将生物学反应过程中产生的各种信息转变成可方便测量的电信号。生物学反应的信息是多元化的，包括各种生物、化学和物理信息，现代电子学、微电子学及传感技术的成果为检测这些信息提供了丰富的手段，为生物传感器的设计提供了足够的方法。表8.1 生物传感器的分子识别元件分子识别元件(生物敏感膜)生物活性材料分子识别元件(生物敏感膜)生物活性材料酶全细胞组织细胞器各种酶类细菌、真菌、动物与植物细胞动物、植物的组织切片线粒体，叶绿体免疫物质生物亲和物质核酸模拟酶抗体,抗原,酶标抗原等配体，受体寡聚核苷酸高分子聚合物表8.2 生物学反应信息与换能器生物学反应信息换能器选择生物学反应信息换能器选择离子变化电荷变化电阻变化、电导变化质子变化气体分压变化热焓变化离子选择性电极电容检测阻抗计，电导仪场效应晶体管气敏电极热敏电阻，热电偶光学变化界面电容改变颜色变化(光学范畴)质量变化力变化振动频率变化光纤，光敏管，荧光计交流阻抗分析仪等光纤，光敏管压电晶体等微悬臂梁表面等离子体共振生物功能物质与分子识别生物传感器的分子识别器件，主要是指来源于生物体的生物活性物质，包括酶、抗原与抗体和各种功能蛋白质、抗体酶、核酸、催化性核酸、激素、微生物细胞、细胞器、动植物组织等，当它们被用作生物传感器的分子识别器件时，具有对靶分子（待检测对象）特异的识别功能。分子识别往往是生物体进行各种简单反应或复杂反应的前奏。分子识别能力决定生物传感器的选择性和灵敏度。因此，了解和掌握生物功能物质的性质及进行分子识别的特征，如酶促反应、免疫反应、核酸与核酸反应（杂交，hybridization）、离子在膜中选择性传输和生物与药物、生物分子间弱相互作用等，对研究和开发生物传感器具有重要的指导意义。生物学反应中的物理量的变化生物反应常常伴随一系列的物理量变化，如热焓、光、颜色、阻抗等，利用这些物理量变化能够设计一些精巧的传感装置。生物反应的热力学任何生物学反应过程都伴随着热力学变化，如分子异构、分子间相互作用、生物催化反应等都会引起系统内部或外部的热变化。生物分子三维结构的改变会引起其功能变化，利用微量测热法测量分子结构转变过程或前后的热信息可以确定蛋白质结构的稳定性。生物发光生物发光(bioluminescence)是指生物体内某些特殊物质的氧化而产生的发光现象。生物发光大多由荧光素酶(1uciferase)催化，如萤火虫的ATP依赖性发光反应等。E + ATP + LH2 E-LH2-AMP +PP E-LH2-AMP + O2 E-L-AMP + H2O +h2 显色反应生物反应过程中的颜色变化包括生物体内产生色素和生物体或酶与底物作用后生成有色物质两个方面。各种色素是由不同的生物合成途径产生的，每一种途径都包含若干生物化学反应，每一种反应都是由特殊的酶催化的。生物功能膜的制备生物膜的模型从层数上来分可分为单层膜、双层膜和多层膜。单层膜主要是指Langmuir-Blodgett(L-B)膜；脂双层膜又包括平板双层膜(planar bilayer)和脂质体(1iposome)，平板双层膜又可分为非支撑平板双层膜(又称黑膜，BLM)和支撑平板双层膜(s-BLM)；多层膜主要指磷脂铸膜(cast lipid film)。Langmuir-Blodgett(L-B)膜技术脂双层膜多层磷脂膜固定化生物功能膜电子传递媒介体生物传感器电子传递媒介体大致有两类:生物体内的天然介体。如细胞色素类(氧化型/还原型，red/ox)、辅酶NAD(P)/NAD(P)H、铁硫蛋白III/铁硫蛋白II等。底物分子脱下的氢，经一系列中间传递体到达分子氧。每对中间传递体都能往复地接受氢或电子，以促进全部生物氧化过程的完成。非生物源介体，包括一些酸碱指示剂、有机染料、金属络合物等。循环伏安法循环伏安法通常采用三电极实验系统即工作电极(working electrode)、对电极(counting electrode)和参比电极(reference electrode)。工作电极可以用金、铂或碳电极等；对电极一般用铂网；参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极。电极在使用前须清洗，工作电极用氧化铝粉抛光，对电极用1 mol L-1硫酸在-0.1+1.1 V之间反复清洗，直至其循环伏安图谱达恒定值，然后再用去离子水洗涤，伏安图谱用电化学分析仪分析记录。(a) (b)图8.3 循环伏安法(a) 电位与时间的关系，线性扫描电位扫至某电位值Em后，再回扫至原来的起始电位值Ei;(b) 典型的循环伏安图(CV), 转换点为回扫的开始电子传递媒介体生物传感器图8.4 电子传递媒介体传感器的反应过程无试剂生物传感器图8.5 三代电化学生物传感器的响应机理蛋白质在电极上的直接电化学蛋白质在金胶纳米粒子修饰电极上的固定与直接电子传递图8.6 胶体金纳米粒子单层的组装和蛋白质在ITO电极上的固定.纳米粒子在无试剂生物传感器制备中的应用生物传感器的应用生物传感器的临床诊断血糖测定乳酸测定尿素及尿酸测定谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)测定免疫传感器一、免疫传感器制备二、电化学免疫传感器三、质量检测免疫传感器四、热量检测免疫传感器五、光学免疫传感器六、免疫传感器的发展生物传感器在发酵与食品工业中的应用氨基酸类酒精测定维生素c与淀粉测定过氧化氢测定 果糖测定DNA阵列DNA阵列的原理DNA微阵列(DNA microarray)是生物芯片技术之一。它将无数预先设计好的寡核苷酸、cDNA或基因组DNA有序地高密度固定排列在载体上(玻璃、硅、塑料等硬质载体)制成点阵，通过与样品中同源核酸进行分子杂交，一次性检测和分析样品中的大量序列。cDNA微阵列与寡核苷酸微阵列并称为核酸微阵列(nucleic acid microarray)。与寡核苷酸微阵列一样，cDNA微阵列也是利用Watson-Crick碱基配对原理，通过分子杂交的化学过程产生微阵列信号，两者所包含的微阵列均以DNA或RNA作为探针分子。cDNA微阵列中的cDNA探针长度一般为0.52.5 kb，用这样的分子制备的微阵列可产生很强的杂交信号。cDNA微阵列可以通过与靶分子杂交平行分析大量基因的mRNA表达谱，根据每个cDNA位置的荧光强度，可以定量测定对应的mRNA水平。DNA阵列的制备方法主要有光引导原位合成法(light-directed synthesis)、压电打印原位合成法(piezoelectric printing in situ synthesis)、合成后交联法(off-chip DNA synthesis attachment)和微点样技术。1. 光引导原位合成法第一步，将载体表面氨基化或羟基化。第二步，在羟基上加光敏保护基团，用光敏保护基团将载体表面的氨基保护起来。第三步，当光线(如紫外线)通过罩在载体上的光刻掩蔽物(mask)时，有光线通过的部分，光敏保护基团脱去，氨基被活化并与加入的一端连有光敏保护基团的脱氧核苷酸反应，使该单体分子连接到载体表面的氨基上。2. 微点样技术制备DNA阵列微点样技术（micro spotting）是利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸和cDNA样品按一定排列规律点在经过特殊处理的玻璃片或其它基片上，利用载体表面的活性基团与核苷酸分子作用形成共价或非共价结合，除去多余寡核苷酸分子并封闭多余活性基因，即制成DNA微阵列。DNA阵列的应用DNA芯片不仅可以用于基因表达分析，揭示基因是否表达、上调或下调，了解完整的基因转录和调控过程，还可从上千个样品中的数以万计的基因座中探查等位基因的异同，提供由于基因异常引起的疾病的信息，也可用于生物基因型分类和基因多态性、细胞因子、黏附分子、受体、离子通道、信号转导、生物大分子化学、细胞周期、应激反应、翻译调控、细胞凋亡、肿瘤鉴定，在疾病和肿瘤诊断、药物靶标筛选、药物评价等方面有重要的用途。图8.19 DNA阵列用于基因表达谱分析流程一、比较基因组研究分析基因组时，检测和确定复杂DNA样品中各种不同序列的相对丰度是非常困难的。利用荧光标记的DNA微阵列方法，可解决这个难题。将864个酵母基因组DNA的l克隆(占酵母基因组的75以上)排列在1.8 cm 1.8 cm的玻璃基片上，总共含有1744个点阵单元。在这种微阵列中，标记不同荧光团的两套不同的分离酵母染色体可同时发生杂交。用激光荧光扫描仪检测来自两种荧光团的杂交信号，可分析复杂的DNA样品。该系统在全基因组的遗传作图、物理作图和基因表达研究等方面有着广泛用途。基因芯片可用于由于基因修饰而影响基因表达改变的研究，如肿瘤细胞中DNA 的异常甲基化可以导致一些癌基因及转移相关基因表达的改变。Melanie等使用4000个基因的芯片GF211研究去甲基化处理前后的高转移性乳腺癌细胞系的基因表达谱证实了DNA异常甲基化是导致nm23-H1表达下调的原因之一。二、肿瘤研究中的应用人黑色素瘤细胞系UACC-903的致瘤特性可以通过导入正常的6号染色体而得到抑制。DeRisi等171构建了含1161个cDNA探针的高密度微阵列，研究了引入6号染色体的黑色素瘤细胞系中与肿瘤抑制相关的基因的表达差异。用于杂交的荧光探针来源于两种细胞mRNAUACC-903和UACC-903(+6)，并标记了不同的荧光素。分析与阵列上每个基因杂交的荧光信号，可确定每个基因对应的两种mRNA样品中的相对丰度。那些以前未发现的特定基因表达的改变则提供了进一步研究这些细胞致瘤表型遗传基础的线索。Khan等用含有1238个cDNA的微阵列研究了一组共7个泡状横纹肌肉瘤(ARMS)细胞系的基因表达谱。采用多维测度法(multidimensional scaling)描述该细胞系在二维欧氏空间里的相互关系，确定了ARMS细胞表现一致的表达谱，从而将这些细胞进行聚类。通过检查这些细胞系，发现这1238个基因中有37个基因在ARMS细胞中表达非常恒定，其中只有3种基因以前报道过在ARMS表达。这37种基因中，有的与ARMS中原发性(PAX3-FKHR)和继发性(CDK4)遗传改变均相关。Heiskanen等将cDNA微阵列技术、比较基因组杂交(CGH)技术和组织微阵列技术结合起来，检测到成纤维细胞生长因子受体2基因(FGFR2)在乳腺癌中的低频扩增。乳腺癌细胞系SUM-52中存在几个高水平DNA扩增位点，包括FGFR2所在的染色体区域10q26。首先利用CGH技术检测基于细菌人工染色体克隆的微阵列，发现FGFR2在SUM-52细胞中有高水平扩增，然后用含588个基因的cDNA微阵列检测到FGFR2在SUM-52细胞中过度表达(超过40倍)，最后用荧光原位杂交(FISH)检测了750例原发性乳腺癌标本的组织芯片，结果显示FGFP2只在1原发性乳腺癌患者体内扩增。三、在其它疾病研究中的应用HeIler等用cDNA微阵列技术分析两种炎性疾病(类风湿性关节炎和炎症性肠病)的基因表达情况，cDNA微阵列是用挑选的可能对炎症具有意义的基因以及表达于外周血单个核细胞的基因制备的。培养的巨噬细胞、软骨细胞系、原代软骨细胞和滑膜细胞的mRNA水平提供了细胞因子、趋化因子、DNA结合蛋白和降解基质的金属蛋白酶的表达谱。通过微阵列技术对这两种疾病组织样品进行比较，发现了涉及其中的许多基因，同时还发现白介素3(IL-3)、趋化因子Gro a和金属蛋白酶基质金属弹性蛋白酶等因子也参与了这两种疾病。通过对外周血文库鉴定发现，类风湿性关节炎与炎症性肠病相比，金属蛋白酶组织抑制剂、铁蛋白轻链和镁超氧化物歧化酶基因的表达有差异。四、在细菌学研究中的应用Ichikawa等用从铜绿假单胞杆菌感染的型肺细胞系A549中提取的RNA制备荧光标记探针，用高密度DNA微阵列(由1506个人cDNA克隆组成)监测了感染的A549细胞中的基因表达，从中鉴定出细菌感染后差异表达的基因。陈永青等利用含有12800个