生物化学实验技能大赛实验设计书.doc

邻二氮菲法测定蔬菜中铁的含量摘 要用邻二氮菲分光光度法直接测定蔬菜中的铁含量，方法简便、快速、准确，为指导人们合理食用蔬菜进行补铁及进一步开发蔬菜产品提供了可靠的理论依据1 2。关键词 蔬菜 铁含量 邻二氮菲1. 前言铁作为必需的微量金属元素，对于人体的健康十分重要。铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其它酶系统的主要组分，可协助氧的运输，还能促进脂肪的氧化。蔬菜是人们摄取微量铁的主要途径之一，缺铁可造成贫血并容易疲劳，而过多则会导致急性中毒。所以，蔬菜中铁含量的测定具有重要的营养学意义，可为指导人们合理食用蔬菜进行补铁以防治缺铁性贫血，提供可靠的理论依据。2. 实验目的综合运用所学知识，用仪器分析法测定金属元素含量；练习灵活运用各种基本操作和查阅资料的能力。3. 实验原理蔬菜中金属元素常与有机物结合成难溶或难于解离的物质，常采用有机物破坏法是被测的金属元素以氧化物或无机盐的形式残留下来，以便测定。本实验采用有机物破坏法（干法），即在高温下加入氧化剂，使有机物质分解。根据不同浓度的物质具有不同的吸光度，采用分光光度法来测定蔬菜中的铁含量。在pH值46的条件下，以盐酸羟胺将三价铁还原为二价铁，二价铁再与邻二氮菲（phen）生成桔红色络合物3，用分光光度计在510nm测定蔬菜中铁的含量。盐酸羟胺还原三价铁的反应如下：2 Fe3+2NH2OHHCl2 Fe2+N2+2H2O+4H+2Cl-邻二氮菲与二价铁的反应式如下：Fe2+ + 3(phen) =Fe(phen)34. 实验器材722型分光光度计（1台），电子天平（1台）蒸发皿（4个），100mL容量瓶(4个)，50mL容量瓶（16个），500mL试剂瓶（7个），大烧杯（4个），量筒（1个），胶头滴管（4个），玻璃棒（4个），1.5mL移液管（2个），5mL移液管（8个），10mL移液管（1个），25mL移液管（1个），漏斗（4个），酒精灯（4个），洗瓶（1个），马弗炉（1个），电磁炉（1台），石棉网，三角架，铁架台/电炉，剪刀（1把），火柴（1盒），标签若干等。5. 实验材料及试剂5. 1实验材料及其处理新鲜菠菜（Spinacia oleracea）、花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）、芹菜（Apium graveolens）、黄瓜（Cucumis sativus Linn.）各0.5Kg将菠菜、花椰菜、芹菜、黄瓜洗净、晾干，准确称取100.0g，用剪刀剪碎，放在蒸发皿中，放于电磁炉上加热至没有浓烟为止。然后放到马弗炉高温烘烤若干小时，最后取出冷却至室温。将上述试样各加入5mL1:1稀释的HCI，至全部溶解。若不溶解可加入数滴硝酸，若还不溶解在酒精灯上加热，冷却后过滤。将滤液转移到50mL的容量瓶中，定容至刻线，待用。5. 2 实验试剂及其配制200ug/mL的铁标准溶液：准确称取0.70g 分析纯FeSO4 (NH4)2 SO46H2O，置于烧杯中用15mL 2mol/L盐酸溶解后移入500mL容量瓶中，定容，摇匀。20ug/mL的铁溶液：用移液管准确移取5mL 200ug/mL 的铁标准溶液于50mL容量瓶中，定容，摇匀。2mol/L的HCI：用移液管准确移取浓盐酸10mL于50mL容量瓶中，定容，摇匀。1:1的HCI：用移液管准确移取浓盐酸25mL于50mL容量瓶中，定容，摇匀。10%的盐酸羟胺：称取盐酸羟胺固体50g，用量筒量取400mL水加热溶解，转移至500mL容量瓶中，定容，摇匀。0.2%的邻二氮菲：准确称取邻二氮菲1.0g，置于烧杯中加热溶解后，移入500mL容量瓶中，定容，摇匀。（临用时配制）1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液：称取醋酸钠（CH3COONa3H2O）固体68g，置于烧杯中,加30ml冰醋酸溶解，加水溶解后，移入500mL容量瓶中，定容，摇匀。浓硝酸（比重1.429g/mL）。6. 实验操作步骤6.1 标准曲线的绘制在6个50mL容量瓶中，按下表由上到下一次加入各试剂。对各容量瓶均用水稀释至刻度，摇匀。容量瓶编号12345620ug/mL铁标溶液/mL0.02.04.06.08.010.010%的盐酸羟胺溶液/mL1.51.51.51.51.51.52min后,1mol/L的醋酸钠溶液/mL5.05.05.05.05.05.00.2%的邻二氮菲溶液/mL1.51.51.51.51.51.5用分光光度计，在波长510nm处用1cm的比色皿，以蒸馏水为参比，测定上述各溶液的吸光度,将数据填入表1，以含铁量为横坐标，吸光度A为纵坐标，根据表1的数据绘制标准曲线。6.2 样品中铁含量的测定取四个50mL的容量瓶，依次加入待测样品液5.0mL,10%的盐酸羟胺溶液1.5mL,摇匀，2分钟后加1mol/L的醋酸钠溶液5.0mL,0.2%的邻二氮菲溶液1.5mL,定容。在分光光度计上，于波长510nm处用1cm的比色皿，以蒸馏水为参比，测定溶液的吸光度值，将数据填入表2。6.3 回收实验取四个容量瓶分别编号1,1，2,2，3,3，4,4,分别在1,1，2,2,3,3,4,4中加入菠菜、花椰菜、芹菜、黄瓜溶液3mL，分别移入50mL的容量瓶中，再在1，2，3，4中加入1mL20ug/mL的铁标溶液，然后分别在两者中加入1.5mL10%的盐酸羟胺溶液， 2min后，再加入5mL 1mol/L的醋酸钠溶液，然后分别加入0.2%的邻二氮菲溶液1.5 mL，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。在分光光度计上，于波长510nm处用1cm的比色皿，以蒸馏水为参比，测定上述溶液的吸光度值，将数据填入表3。7. 结果及计算表1 标准曲线测量数据及记录结果（A1,A2,A3为同种试验材料的三个比色皿重复，下面出现与此处意义相同）编号123456铁的含量/ug04080120160200吸光度A1A2A3平均值表2 铁含量测量数据及记录结果菠菜花椰菜芹菜黄瓜A1A2A3平均值从标准曲线查得铁质量/ug结论：表3 回收率测量数据及记录结果菠菜花椰菜芹菜黄瓜11223344A1A2A3平均值回收率结论：8. 注意事项8.1 分光光度法测定的条件：分光光度法测定物质含量时应注意的事项，主要是显色反应的条件和测定吸光度值的条件。显色反应的条件包括显色剂的用量、介质的酸度、显色时温度、显色时间及干扰物质的消除等；测量吸光度值的条件包括入射光波长的选择、吸光度范围和参比溶液等。8.2 邻二氮菲-亚铁络合物：邻二氮菲是测定微量铁的一种较好的试剂。在pH=29的条件下Fe2+离子与邻二氮菲生成稳定的橘红色络合物。测定时，控制溶液酸度在pH=5左右较为适宜。酸度过高，反应进行较慢；酸度太低，则 Fe2+离子水解，影响显色。8.3 实验报告：实验报告要进行数据记录，并进行处理，最后要得出结论。9. 费用预算材料费:材料单价/元数量/Kg总价/元菠菜4.00.52.0花椰菜3.00.51.5芹菜5.00.52.5黄瓜4.00.52.0总计/元10.0资料费: 30.0元交通费：2