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HPLC检测饲料中孔雀石绿的方法 孔雀石绿（malachitegreen）又称为苯胺绿、维多利亚绿或中国(China)绿，是一种具有金属光泽的绿色晶体。孔雀石绿的化学官能团三苯沼气(CH4)是一种致癌物资，且其易在鱼体内和情况中残留，存在致突变、致畸和致癌的危险，故我国、美国(United States)、加拿大(Canada)以及欧盟等很多国度均制止其在经济鱼类（观赏鱼除外）和人类食用鱼中应用。鱼粉是饲猜中动物卵白的重要起源，含有孔雀石绿及其代谢物的鱼粉添加到饲猜中可经由进程食品链要挟到人类健康。 我所现采用NY/T 1756-2009标准，应用高效液相色谱法（HPLC）对饲料中孔雀石绿进行测定，本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为 10g/kg；液相色谱-串联质谱法的定量限均为 1.0 g/kg。现将该方法简要介绍如下： 1.原理 以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取，再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。 2. 分析步骤 2.1 提取 称取饲料样品约 5g (精确到 0.001g) ，置于100ml离心管中，依次加入1.5ml盐酸羟胺溶液、2ml对甲苯磺酸溶液、5ml乙酸钠缓冲溶液和 20 ml乙腈，加入约2g 酸性氧化铝，振荡2min，超声30 min，4 000 r/min 离心5 min。将上清液转移至250 ml分液漏斗中，向离心管中再次加入20 ml乙腈，振摇2 min，4000 r/min 离心5 min，合并上清液至分液漏斗中。 2.2 液液萃取 加入50ml氯化钠溶液、50ml二氯甲烷，旋摇，静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入 20ml二氯甲烷，旋摇，静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液35下减压旋转蒸发(注意：开始时温度不要直接升35，以免爆沸)至近干，加入5 ml，乙腈溶解残渣，备用。 2.3 净化 2.3.1 固相萃取柱的活化 按中性氧化铝柱在上、PRS 柱在下的顺序将两柱串联，使用前用 5ml乙腈预洗两柱。 2.3.2上样 将2.3.1的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内,在抽真空情况下过柱(保持流速 1 mlmin) 。再用5ml乙腈洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，最后用 5 ml乙腈洗涤小柱。 2.3.3洗脱收集 弃去中性氧化铝柱，用乙腈-乙酸钠缓冲溶液2ml、盐酸羟胺甲醇溶液lml洗脱，收集洗脱液，过膜(孔径 0.45m)，上机测定。 2.4样品测定 2.4.1色谱条件 色谱柱：氰基柱，250 mm 4.6 mm，柱后氧化铅柱：35 mm4.6 mm。 流动相：乙腈乙酸钠缓冲溶液6040 (vv) ； 流速：1.0 ml/min 。 柱温：室温。 进样量：50 l。 检测波长：600 nm。 2.4.2定量测定 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液及试样溶液，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。1 氯霉素类药物概述氯霉素类药物是应用广泛的广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗中，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用。氯霉素最初是从委内瑞拉链丝菌的培养液中提取制得，现在基本使用化学合成法大量生产。其性质稳定，在干燥状态下可保存药效达2年以上，易溶于有机溶剂，25 时100 ml水中仅溶解25 mg。水溶液呈中性，在酸性和中性溶液中较稳定，遇碱类易分解失效。其合成品具有左旋光性，也称左霉素。2 氯霉素残留对人类健康的危害2.1 骨髓造血机能紊乱氯霉素对骨髓造血机能有抑制作用，可引起血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、溶血性等，多数在长期或多次用药的过程中发生。2.2 对早产儿和新生儿的毒性在早产儿和新生儿肝内有些酶系统发育尚不完全，葡萄糖醛酸结合的能力较差，因此影响氯霉素在肝中的解毒作用；此外，肾脏排泄能力亦较弱，能招致药物蓄积中毒。2.3 胃肠道症状、口部症状胃肠道反应主要有腹胀、腹泻、食欲减退，恶心、呕吐则少见。口部症状如口腔粘膜充血、疼痛、糜烂、口角炎和舌炎等。2.4 其它不良反应可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。有时发生中毒性精神病，主要表现为幻视、幻听、定向力丧失、精神失常等。3 氯霉素残留对我国动物产品出口的影响氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。几年来，我国出口到欧盟、美国等地区的水产品、蜂蜜等多次因为氯霉素超标被限制，损失达到数十亿美元。4 氯霉素残留检测方法近年来各种关于氯霉素残留的检测方法不断涌现，大致可分为三大类：第一类是生物测定法，第二类是理化分析法，第三类是兼有生物和化学的酶联免疫检测法。4.1 筛选检验方法在实际工作中，不可能也没必要对所有动物性水产品进行各种复杂、昂贵且耗时的分析检测。为能快速确定动物食品中是否有氯霉素残留，通常做法是遵循一定程序，对被测产品进行取样，按规范要求对样品进行筛选检验，对筛选为阳性的样品再用更精确的方法进行定量鉴定。4.1.1 微生物法在快速筛选检验程序中，微生物法非常有效，这类方法简单、费用少、速度快，因而广泛用于动物性食品兽药残留的初筛。4.1.1.1 棉签法棉签法又称现场拭子法，是检测动物体中抗生素残留的现场试验方法。该方法是用棉签（拭子）采取动物体内的组织液，然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中保温过夜。观察是否在拭子周围出现抑菌环，若有，即表明组织液中有抗生素存在。如果该动物仅用氯霉素进行过治疗，则可以认为该组织中存在氯霉素残留。此方法在几分钟内即可完成取样操作，1618 h即可获得结果，是简便易行而又有一定准确性的检测方法，比较适合基层现场筛选检测。但是该检测法灵敏度较差，检出限较高，多在g/g级，特异性差，一般抗生素类药物都有此类反应，而且不能定量。4.1.1.2杯碟法样品经处理后，注入牛津杯中，与含菌液的检定平板贴合，培养后，根据抑菌圈有无及大小判定结果。采用不同的试验菌种，可检测不同的抗生素。此法检出限为0.25 g/g。这种方法与棉签法相比，灵敏度高，能够排除一定的干扰，但要进一步提高灵敏度很困难。4.1.2免疫分析方法免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。免疫反应具有很高的选择性和灵敏性，因此，免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。作为相对独立的检测方法，即基于竞争结合分析原理的免疫测定法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）、固相免疫传感器等。目前使用最普遍的酶联免疫法（ELISA），具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度和分析成本低的优点，是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。ELISA是基于抗原和抗体反应而建立的。由于氯霉素是半抗原，不能刺激机体产生抗体。要使半抗原性物质具有免疫原性,就需使其与大分子载体物质(蛋白质)相结合制备人工抗原,而后将其作为抗原进行使用,动物体内即可产生相应特异性的抗氯霉素的抗体,在此基础上建立酶联免疫竞争法测定氯霉素含量。此种方法灵敏度高，检测下限可达0.05 g/kg，重现性好，回收率高，在1 g/kg的添加水平下，回收率可达107%113%。酶联免疫法的缺点在于影响因素较多,易出现大量假阳性结果;抗体批次不同,测定结果也会出现差异。4.2 定量确认方法4.2.1 高效液相色谱法高效液相色谱法检测氯霉素是一种灵敏度较高、可靠性较强的一种方法，此法重复性好、假阳性少，可以进行定量鉴定，但检出限较高，为510 g/kg，回收率偏低。因为动物体内成分复杂，一些杂质干扰测定，应用该法检测时，对于样品预处理必须仔细谨慎，以提高测定准确性和灵敏度。4.2.2气相色谱法目前较常用的氯霉素确证方法是气相色谱法,该方法的特点是高分离效能、高选择性、高灵敏度、检出限低、快速、应用广,还可用于制备高纯物质。它可以对于分配系数相差很近的组分进行分离,从而分离出极为复杂的混合物。检出限一般为g/kg级,常用于抗生素药物残留的检测。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步聚,因而限制了气相色谱法的应用。饲料中氯霉素含量的检测目前采用气相色谱法。该方法先将配合饲料用乙酸乙酯提取，取部分提取液用氮气吹去乙酸乙酯后，残渣用甲醇/氯化钠溶液溶解，用正己烷液液萃取除去油脂及脂溶物，氯霉素再用乙酸乙酯提取、吹干，C18小柱净化，经衍生剂衍生后用配有电子捕获检测器的气相色谱检测。气相色谱条件如下。载气：氮气1.5 ml/min；补充气：氮气25 ml/min；分流比：1：10。温度：气化室280 ；检测器300 ；柱箱230 。在上述仪器条件下，注入标准工作液1 l，调整试样定容体积使试样溶液中氯霉素的峰值与标准工作液中氯霉素峰值相近，以保留时间和峰值的比较对氯霉素进行定量计算。重复性：两个平行测定的结果相对偏差不得大于5。回收率：添加量在0.01 mg/kg时，回收率在90%105%。该方法的最低检出限为0.005 mg/kg。5 结论总的来说，基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，试样预处理简单，分析时间短。近几年酶联免疫法得到了很大的发展,假阳性率明显降低,而且适应广泛。目前在肉类、鱼虾、蛋品、尿液、血清、牛奶、蜂蜜及饲料中都用酶联免疫法来做氯霉素检测的筛选。国际上公认的定量确认方法仍是理化分析法，主要是气相色谱法和液相色谱法，这两种方法灵敏度高，结果准确，重复性好，假阳性少，缺点是样品前处理过程复杂、仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢。二者相比较，由于HPLC检出限较高，已逐渐不能满足发达国家对检测方法检出限的要求。联用技术出现后，LC-MS由于灵敏度高,检出限更低,结果精确可靠,在氯霉素残留的分析中正逐渐代替单一的色谱技术。饲料中铅的测定方法GB 130801991A.1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中铅的测定。 本标准适用于饲料原料（磷酸盐、石粉、鱼粉等）、配合饲料（包括混合饲料）中铅的测定。A.2 原理 样品经消解处理后，再经萃取分离，然后导入原子吸收分光光度计中，原子化后测量其在283.3nm处的吸光度，与标准系列比较定量。A.3 试剂和溶液 除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为去离子重蒸馏水或相应纯度的水。A.3.1 硝酸，优级纯。A.3.2 硫酸，优级纯。A.3.3 高氯酸，优级纯。A.3.4 盐酸，优级纯。A.3.5 甲基异丁酮CH3COCH2CH（CH3）2，HG 31118。A.3.6 6mol/L硝酸溶液：量取38mL硝酸，加水至100mL。A.3.7 1mol/L碘化钾溶液：称取166g碘化钾（KI，GB 1272），溶于1000mL水中，储存于棕色瓶中。A.3.8 1mol/L 盐酸：量取84mL盐酸，加水至1000mL。A.3.9 5%抗坏血酸溶液：称取5.0g抗坏血酸（C6H8O6），溶于水中，稀释至100mL，储存于棕色瓶中。A.3.10 铅标准储备液：精确称取0.1598g硝酸铅（HG 31070），加6mol/L硝酸10mL，全部溶解后，转入1000mL容量瓶中，加水至刻度，该溶液为每毫升0.1mg铅。A.3.11 铅标准工作液：精确吸取1mL铅标准储备液，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液为每毫升1g铅。A.4 仪器、设备A.4.1 消化设备：两平行样所在位置的温度差小于或等于5。A.4.2 马福炉。A.4.3 分析天平；感量0.0001g。A.4.4 实验室用样品粉碎机。A.4.5 振荡器。A.4.6 原子吸收分光光度计。A.4.7 容量瓶：25、50、100、1000mL。A.4.8 吸液管：1、2、5、10、15mL。A.4.9 消化管。A.4.10 瓷坩埚。A.5 试样制备采集具有代表性的饲料样品，至少2kg，四分法缩分至250g，磨碎，过1mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，低温保存备用。A.6 测定步骤A.6.1 试样处理A.6.1.1 配合饲料及鱼粉试样处理称取4g样品，精确到0.001g，置于瓷坩埚中缓慢加热至炭化，在500高温下加热18h，直至试样呈灰白色。冷却，用少量水将炭化物湿润，加5mL硝酸，5mL高氯酸，用表面皿盖住，在砂浴或加热装置上加热，待消解完全后，去掉表面皿，至近干涸。加10mL 1mol/L盐酸，使盐类溶解，把溶液倒入50mL容量瓶中，用水冲洗烧杯多次，加水至刻度。用中速滤纸过滤，待用。A.6.1.2 磷酸盐、石粉试样处理称取5g样品，精确到0.001g，放入消化管中，加入5mL水，使样品湿润，依次加入20mL硝酸，5mL硫酸，置4h后加入5mL高氯酸，放在消化装置上加热消化。在150恒温消化2h，然后将温度缓缓升到300，在300下恒温消化，直至样品发白近干为止，取下消化管，放冷。加入1mol/L盐酸10mL，在150温度下加热，使样品中盐类溶解后将溶液倒入50mL容量瓶中，用水冲洗消化管，将冲洗液并入容量瓶中，加水至刻度。用中速滤纸过滤，备作原子吸收用。A.6.2 标准曲线给制精确吸取0、4、8、12、16、20mL 1g/mL的铅标准工作液，加到25mL容量瓶中，加水至20mL。准确加入2mL 1mol/L碘化钾溶液，振动摇匀；加入1mL抗坏血酸溶液，振动摇匀；准确加入2mL甲基异丁酮溶液，激烈振动3min，静置萃取后，将有机相导入原子吸收分光光度计。在283.3nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。A.6.3 测定精确吸取5mL10mL样品溶液和试剂空白液加入到25mL容量瓶中，按绘制标准曲线步骤进行测定，测出相应吸光值和标准曲线比较定量。A.7 测定结果A.7.1 计算公式 (A1 A2)1000m1000V2 /V1XV1 ( A1A2) mV2（1）式中：X试样中铅的含量，mg/kg；m 试样质量，g； V1试样消化液总体积，m；V2测定用试样消化液体积，m。A1测定用试样消化液铅含量，g；A2空白试液中铅含量，g。 A.7.2 结果表示每个试样取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果表示到0.01mg/kg。附录B （规范性附录）饲料中汞的测定方法GB 130811991B.1 主题内容与适用范围本标准规定了饲料中汞的测定方法。本标准适用于各类饲料中汞的测定。B.2 原理在原子吸收光谱中，汞原子对波长为253.7nm的共振线有强烈的吸收作用。试样经硝酸硫酸消化使汞转为离子状态，在强酸中，氯化亚锡将汞离子还原成元素汞，以干燥清洁空气为载体吹出，进行冷原子吸收，与标准系列比较定量。B.3 试剂和溶液除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为重蒸馏水或相应纯度的水。B.3.1 硝酸。B.3.2 硫酸。B.3.3 30氯化亚锡溶液：称取30g氯化亚锡（GB 638），加少量水，再加2mL硫酸使溶解后，加水稀释至100mL，放置冰箱备用。B.3.4 混合酸液：量取10mL硫酸，加入10mL硝酸，慢慢倒入50mL水中，冷后加水稀释至100mL。B.3.5 汞标准贮备液：准确称取干燥器内干燥过的二氯化汞0.1354g，用混合酸液溶解后移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1mg汞，冷藏备用。B.3.6 汞标准工作液：吸取1.0mL汞标准贮备液，置于100mL容量瓶中，加混合酸液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于10g汞。再吸取此液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加混合酸液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.1g汞，临用时现配。B.4 仪器、设备B.4.1 分析天平：感量0.0001g。B.4.2 实验室用样品粉碎机或研体。B.4.3 消化装置。B.4.4 测汞仪。B.4.5 三角烧瓶：250mL。B.4.6 容量瓶：100mL。B.4.7 还原瓶：50mL（测汞仪附件）。B.5 试样制备采集具有代表性的饲料样品，至少2kg，四分法缩分至250g，磨碎，过1mm孔筛，装入密闭容器，低温保存备用。B.6 测定步骤B.6.1 试样处理称取1g5g试样，精确到0.001g，置于三角瓶中，加玻璃珠数粒，加25mL硝酸，5mL硫酸，转动三角瓶防止局部炭化，装上冷凝管，小火加热，待开始发泡即停止加热，发泡停止后，再加热回流2h。放冷后从冷凝管上端小心加20mL水，继续加热回流10min，放冷，用适量水冲洗冷凝管，洗液并入消化液。消化液经玻璃棉或滤纸滤于100mL容量瓶内，用少量水洗三角烧瓶和滤器，洗液并入容量瓶内，加水至刻度，混匀。取试样处理时相同量的硝酸、硫酸，同法做试剂空白试验。若为石粉，称取约1g试样，精确到0.001g，置于三角烧瓶中，加玻璃珠数粒，装上冷凝管后，从冷凝管上端加入15mL硝酸，用小火加热15min，放冷，用适量水冲洗冷凝管，移入100mL容量瓶内，加水至刻度，混匀。B.6.2 标准曲线绘制吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL汞标准工作液（相当于0、0.01、002、0.03、0.04、0.05g的汞），置于还原瓶内，各加10mL混合酸液，加2mL氯化亚锡溶液后立即盖紧还原瓶2min，记录测汞仪读数指示器最大吸光度。以吸光度为纵坐标，汞浓度为横坐标，绘制标准曲线。B.6.3 测定加10mL试样消化液于还原瓶内，加2mL氯化亚锡溶液后立即盖紧还原瓶2min，记录测汞仪读数指示器最大吸光度。B.7 测定结果B.7.1 计算公式（A1A0）1000m1000 V2/ V1 X =V1(A1A0)mV2 式中：X试样中汞的含量，mg/kg；A1测定用试样消化液中汞的质量，gA0试剂空白液中汞的质量，gm试样质量，g；V1试样消化液总体积，mL；V2测定用试样消化液体积，mL。B.7.2 结果表示每个试样平行测定2次，以其算术平均值为结果。结果表示到0.001mg/kg。附录C （规范性附录）饲料中镉的测定方法GB 130821991C.1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中镉的测定方法。 本标准适用于饲料中镉的测定。C.2 原理 以干灰化法分解样品，在酸性条件下，有磺化钾存在时，镉离子与碘离子形成络合物，被甲基异丁酮萃取分离，将有机相喷入空气乙炔火焰，使镉原子化，测定其对特征共振线228.8nm的吸光度，与标准系列比较而求得镉的含量。C.3 试剂和溶液 除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。C.3.1 硝酸，优级纯。C.3.2 盐酸，优级纯。C.3.3 2mol/L碘化钾溶液：称取332g碘化钾，溶于水，加水稀释到1000mL。C.3.4 5%抗坏血酸溶液：称取5g抗坏血酸，溶于水，加水稀释至100mL（临用时配制）。C.3.5 1mol/L盐酸溶液：量取10mL盐酸，加入110mL水，摇匀。C.3.6 甲基异丁酮CH3COCH2CH（CH3）2，HG3-1118。C.3.7 镉标准贮备液：称取高纯金属镉（Cd，99.99%）0.1000g于250mL三角烧瓶中，加入10mL1:1硝酸，在电热板上加热溶解完全后，蒸干，取下冷却，加入20mL 1:1盐酸及20mL水，继续加热溶解，取下冷却后，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升相当于100g镉。C.3.8 镉标准中间液：吸取10mL镉标准贮备液于100mL容量瓶中，以1mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升相当于10g镉。C.3.9 镉标准工作液：吸取10mL镉标准中间液于100mL容量瓶中，以1mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升相当于1g镉。C.4 仪器、设备C.4.1 分析天平；感量0.0001g。C.4.2 马福炉。C.4.3 原子吸收分光光度计。C.4.4 硬质烧杯：100mL。C.4.5 容量瓶：50mLC.4.6 具塞比色管：25mL。C.4.7 吸量管：1、2、5、10mL。C.4.8 称液管：5、10、15、20mL。C.5 试样制备采集具有代表性的饲料样品，至少2kg，四分法缩分至约250g，磨碎，过1mm筛，混匀，装入密闭广口试样瓶中，防止试样变质，低温保存备用。C.6 测定步骤C.6.1 试样处理 准确称取5g10g试样于100mL硬质烧杯中，置于马福炉内，微开炉门，由低温开始，先升至200保持1h，再升至300保持1h，最后升温至500灼烧16h，直至试样成白色或灰白色，无碳粒为止。 取出冷却，加水润湿，加10mL硝酸，在电热板或砂浴上加热分解试样至近干，冷后加10mL 1moL/L盐酸溶液，将盐类加热溶解，内容物移入50mL容量瓶中，再以1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀备用。 若为石粉、磷酸盐等矿物质试样，可不用干灰化法，称样后，加10mL15mL硝酸（或盐酸），在电热板或砂浴上加热分解试样至近干，其余同上处理。C.6.2 标准曲线绘制 精确分取镉标准工作液0、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00mL，分别置于25mL具塞比色管中，以1mol/L盐酸溶液稀释至15mL，依次加入2mL碘化钾溶液，摇匀，加1mL抗坏血酸溶液，摇匀，准确加入5mL甲基异丁酮，振动萃取3 min5min，静置分层后，有机相导入原子吸收分光光度计，在波长228.8nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，深度为横坐标，绘制标准曲线。C.6.3 测定准确分取15mL20mL待测试样溶液及同量试剂空白溶液于25mL具塞比色管中，依次加入2mL碘化钾溶液，其余同标准曲线绘制测定步骤。C.7 测定结果C.7.1 计算公式 (A1- A2)mV2 /V1XV1 ( A1- A2) mV2（1）式中：X试样中镉的含量，mg/kg；A1待测试样溶液中镉的含量，g；A2试剂空白溶液中镉的含量，g。m试样质量，g； V2待测试样溶液体积，m；V1试样处理液总体积，m。C.7.2 结果表示 每个试样取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 结果表示到0.01mg/kg。附录D 饲料中总砷的测定GB/T 130791999D.1 范围 本标准规定了饲料中总砷的测定方法。 本标准适用于各种配（混）合饲料、浓缩饲料、预混合饲料及饲料原料。D.2 原理样品经酸消解或干灰化破坏有机物，使砷呈离子状态存在，经碘化钾、氯化亚锡将高价砷还原为三价砷，然后被锌粒和酸产生的新生态氢还原为砷化氢。在密闭装置中，被二乙氨基二硫代甲酸银（AgDDTC）的三氯甲烷溶液吸收，形成黄色或棕红色银溶胶，其颜色深浅与砷含量成正比，用分光光度计比色测定。形成胶体银的反应如下：AsH3+6Ag（DDTC）=6Ag+3H（DDTC）+As（DDTC）3D.3 试剂除特殊规定，所用的试剂均为分析纯，水系蒸馏水或相应纯度的水。D.3.1 硝酸D.3.2 硫酸D.3.3 高氯酸D.3.4 盐酸D.3.5 抗坏血酸D.3.6 无砷锌粒，粒径3.0mm0.2mm.。D.3.7 混合酸溶液（A）：HNO3:H2SO4:HCIO423:3:4D.3.8 乙酸铅棉花：将医用脱脂棉在乙酸铅溶液（100g/L）中浸泡约1h，压除多余溶液，自然晾干，或在90100烘干，保存于密闭瓶中。D.3.9 二乙氨基二硫代甲酸银（AgDDTC）三乙胺三氯甲烷吸收溶液：2.5g/L。 称取2.5g（精确到0.0002g）AgDDTC于干燥的烧杯中，加适量三氯甲烷待完全溶解后，转入1000mL容量瓶中，加入20mL三乙胺，用三氯甲烷定容，于棕色瓶中存放于冷暗处。若有沉淀应过滤后使用。D.3.10 3.10砷标准储备溶液：1.0mg/mL 精确称取0.660g三氯化二砷（110下干燥2h），加5mL氢氧化钠溶液（200g/L）使之溶解，然后加入25mL硫酸溶液（60mL/L）中和，定容至500mL。此溶液每毫升含1.00mg砷，于塑料瓶中冷贮。D.3.11 砷标准工作溶液：1.0g/mL。准确吸取5.00mL砷标准储备液（3.10）于100mL容量瓶中，加水定容，此溶液含砷50g/mL。准确吸取50g/mL砷标准溶液2.00mL，于100mL容量瓶中，加1mL盐酸，加水定容，摇匀，此溶液每毫升相当于1.0g砷。D.3.12 硫酸溶液：60mL/L。吸取6.0mL硫酸，缓慢加入约80mL水中，冷却后用水稀释至100mL。D.3.13 盐酸溶液：（HCI）1mol。量取84.0mL盐酸（3.4），倒入适量水中，用水稀释至1。D.3.14 盐酸溶液：（HCI）3mol。将1份盐酸与3份水混合。D.3.15 硝酸镁溶液：150g/L。称取30g硝酸镁Mg（HNO3）26H2O溶于水中，并稀释至200mL。D.3.16 碘化钾溶液：150g/L。称取75g碘化钾溶于水中，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。D.3.17 酸性氯化亚锡溶液：400g/L。称取20g氯化亚锡（SnCI22 H2O）溶于50mL盐酸中，加入数颗金属锡粒，可用一周。D.3.18 氢氧化钠溶液：200g/L。D.3.19 乙酸铅溶液：200g/L。D.4 设备D.4.1 砷化氢发生及吸收装置。D.4.1.1 砷化氢发生器：100mL带30mL、40mL、50mL刻度线和侧管的锥形瓶。D.4.1.2 导气管：管径为8.0mm8.5mm；尖端孔为2.5mm3.0mm。D.4.1.3 吸收瓶：下部带5mL刻度线。D.4.2 分光光度计：波长范围360nm800nm。D.4.3 分析天平：感量0.0002g。D.4.4 可调温电炉：六联和二联各一个。D.4.5 玻璃器皿：凯氏瓶，各种刻度吸量管，容量瓶和高型烧杯。D.4.6 瓷坩锅：30mL。D.4.7 高温炉：温控0950。D.5 分析步骤D.5.1 样品制备选择有代表性样品1.0kg，用四分法缩减至250g，过0.42mm孔筛，存于密封瓶中，待用。D.5.1.1 混合酸消解法配合饲料及植物性单一饲料，宜采用硝酸硫酸高氯酸消解法。称取试样3g4g（精确至0.001g），置于250mL凯氏瓶中，加水少许湿润试样，加30mL混合酸（），放置4h以上或过夜，置电炉上从室温开始消解。待棕色气体消失后，提高消解温度，至冒白烟（SO3）数分钟（务必赶尽硝酸），此时溶液应清亮无色或淡黄色，瓶内溶液体积近似硫酸用量，残渣为白色。若瓶内溶液呈棕色，冷却后添加适量硝酸和高氯酸，直到消解完全。冷却，加10mL盐酸溶液（3.13）并煮沸，稍冷，转移到50mL容量瓶中，洗涤凯氏瓶35次，洗液并入容量瓶中，然后定容，摇匀，待测。试样消解液含砷小于10g时，可直接转移到砷化氢发生器中，补加7mL盐酸，加水使瓶内溶液体积为40mL，从加碘化钾起以下按5.3操作步骤进行。D.5.1.2 盐酸溶样法磷酸盐、碳酸盐和微量元素添加剂不宜加硫酸，应用盐酸溶样。称取试样1g3g（精确至0.0002g）于100mL高型烧杯中，加水少许湿润试样，慢慢滴加10mL盐酸溶液（3.14），待激烈反应过后，再缓慢加入8mL盐酸，用水稀释至约30mL，煮沸。转移到50mL容量瓶中，洗涤烧杯34次，洗液并入容量瓶中，定容，摇匀，待测。试样消解液含砷小于10g时，可直接在发生器中溶样，用水稀释到40mL并煮沸，从加碘化钾起以下按5.3操作步骤进行。另外，少数矿物质饲料富含硫，严重干扰砷的测定，可盐酸溶解样品后（5.1.2），往高型杯中加入5mL乙酸铅溶液（3.19）并煮沸，静置20min，形成的硫化铅沉淀过滤除之，滤液定容至50mL，以下按5.3规定步骤进行。D.5.1.3 干灰化法预混料、浓缩饲料（配合饲料）可选择干灰化法。称取试样2g3g（精确至0.0002g）于30mL瓷坩埚中，低温炭化至无烟后，加入5mL硝酸镁溶液（3.15），混匀，于低温或沸水浴中蒸干，然后转入高温炉于550恒温灰化3.5h4.0h。取出冷却，缓慢加入10mL盐酸溶液（3.14），待激烈反应过后，煮沸并转移到50mL容量瓶中，洗涤坩埚35次，洗液并入容量瓶中，定容，摇匀，待测。所称试样含砷小于10g时，可直接转移到发生器中，补加8mL盐酸，加水至40mL左右，加入1g抗坏血酸溶解后，按5.3操作步骤进行。同时于相同条件下，做试剂空白试验。D.5.2 标准曲线绘制准确吸取砷标准工作溶液（1.0g/mL）0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL于发生瓶中，加10mL盐酸，加水稀释至40mL，从加入碘化钾起，以下按5.3步骤操作，测其吸光度，求出回归方程各参数或绘制出标准曲线。当更换锌粒批号或者新配制AgDDTC吸收液、碘化钾溶液和氯化亚锡溶液，均应重新绘制标准曲线。D.5.3 还原反应与比色测定从5.1.1、5.1.2、5.1.3处理好的待测液中，准确吸取适量溶液（含砷量应1.0g）于砷化氢发生器中，补加盐酸至总量为10mL，并用水稀释到40mL，使溶液中盐酸浓度为3mol/L，然后向试样溶液、试剂空白溶液、标准系列溶液各发生器中，加入2mL碘化钾溶液（150g/L），摇匀，加入1mL氯化亚锡溶液（3.17），摇匀，静置15min。准确吸取5.00mL AgDDTC吸收液于吸收瓶中，连接好发生吸收装置（勿漏气，导管塞有膨松的乙酸铅棉花）。从发生器侧管迅速加入4g无砷锌粒，反应45min，当室温低于15时，反应延长至1h。反应中轻摇发生瓶2次，反应结束后，取下吸收瓶，用三氯甲烷定容至5mL，摇匀（避光时溶液颜色稳定2h）。以原吸收液（3.9）为参比，在520nm处，用1cm比色池测定。D.6 分析结果的计算与表述D.6.1 结果计算每千克饲料中砷含量按式（1）计算：A1V11000mV21000（1）式中：每千克样品中含砷量，mg；V1 试样消解液总体积，mL；V2分取试液体积，mL；A1测试液中含砷量，g；m 试样质量，g 。若样品中砷含量很高，可用式（2）计算：A2V1V31000mV2V41000（2）式中：每千克样品中含砷量，mg；V1试样消解液总体积，mL；V2分取试液体积，mL；V3分取液再定容体积，mL；V4测定时分取V3的体积，mL；A2测试液中含砷量，g；m 试样质量，g 。D.6.2 结果表示每个样品应做双样，以其算术平均值为分析结果，并表示至小数点后两位。当每千克试样中含砷量1.0g时，结果取三位有效数字。附录E 饲料中六六六、滴滴涕的测定GB/T 130901999E.1 范围本标准规定了饲料中六六六的四种异构体和滴滴涕的四种衍生物的含量的气相色谱测定方法。本标准适用于配合饲料、植物性原料及鱼粉中六六六、滴滴涕异构体及衍生物（见表1）的检测。检测范围：每千克饲料中六六六为5g500g ，滴滴涕为10g1000g 。通 用 名国际系统名（ISO1750）化学名称（IUPAC1）方法定量检测限(MLQ)(每千克饲料中g )六六六甲体六六六乙体六六六丙体六六六(林丹)丁体六六六滴滴涕（DDT）对，对/滴滴依邻，对/滴滴涕对，对/滴滴依邻，对/滴滴涕HCH(BHC)HCH(BHC)- HCH(BHC)-HCH(-BHC或Lindane)- HCH(BHC)DDTp,p/-DDEo,p/-DDEp,p/-DDE(TDE)p,p/-DDE(DDT) 六氯环已烷(有下列四个异构体)1,3,5/2,4,6六氯环已烷1,2,4,5/3,6六氯环已烷1,2,3,4,5,6六氯环已烷1,2,3/4,5,6六氯环已烷二氯二苯基三氯乙烷(有下列四种衍生物)1,1二氯2,2双(4氯苯基)乙烯1,1,1三氯2(2氯苯基)2(4氯苯基)乙烷1,1-二氯2，2双(4氯苯基)乙烷1,1,1-三氯2,2双(4氯苯基)乙烷5555101010101）国际理论和应用化学联合会E.2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 81701987 数值修约规则GB/T 14699.11993 饲料采样方法ISO 1750:1981 Pesticides and other agrochemicals-Commom namesE.3 原理 样品中的六六六、滴滴涕采用含有少量丙酮的正已烷混合溶剂提取、过滤并定容，从中吸出一定量的提取液直接用硫酸酸化过的硅藻土微柱净化，正已烷洗脱液直接注入气相色谱仪，用电子捕获检测器检测，以外标法定性和定量。E.4 试剂 除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为重蒸馏水或相应纯度的水。E.4.1 所有试剂在条件允许情况下，使用色谱纯的试剂。E.4.2 异辛烷：配置标准溶液用，在六六六、滴滴涕出峰处应无干扰峰，最好选择优级纯或色谱纯的试剂。E.4.3 正已烷：沸程67.569.5。E.4.4 丙酮。E.4.5 提取液：正已烷丙酮（223）。E.4.6 发烟硫酸：含三氧化硫（SO3）2025，优级纯。E.4.7 浓硫酸：优级纯。E.4.8 磷酸。E.4.9 无水硫酸钠：500烘4h，在高温烘箱中冷至200左右，放入干燥器中冷后密封备用。E.4.10 吸附剂：柱层析用。硅藻土 孔径：177m600m (30目80目) Celite 545 孔径：20m45m。 500烘4h，在高温烘箱中放冷至200，置于干燥器中冷后密封备用。E.4.11 脱脂棉：用丙酮浸泡30min后，倾去丙酮，再用正已烷浸泡30min，弃去正已烷，晾干备用。E.4.12 六六六标准贮备液：HCH0.100mg/mL，国家标准物质研究中心制，贮于安瓿中，低温及避光下保存，有效期壹年.甲体-六六六(-HCH) GBW(E)060081乙体六六六(- HCH) GBW(E)060082丙体六六六(-HCH) GBW(E)060083丁体六六六(- HCH) GBW(E)060084E.4.13 滴滴涕标准贮备液: DDT0.100mg/mL，国家标准物质研究中心制，贮于安瓿中，低温及避光下保存，有效期壹年。p,p/-DDT GBW(E)060102o,p/-DDT GBW(E)060103p,p/-DDE GBW(E)060104p,p/-DDD GBW(E)060105E.4.14 六六六中等浓度贮备液：HCH1.00g /mL。将四支六六六标准贮备液（4.12），分别用异辛烷（4.2）在棕色容量瓶中稀释1000倍，密封贮放于暗处，4左右保存可稳定半年。E.4.15 滴滴涕中等浓度贮备液：HCH10.0g /mL。将四支滴滴涕标准贮备液（4.13），分别用异辛烷（4.2）在棕色容量瓶中稀释10倍，密封贮放于暗处，4左右保存可稳定半年。E.4.16 系列混合标准工作液：分别用移液管吸六六六中等浓度标准贮备液-HCH 10.0mL，- HCH 30.0mL，-HCH 8.00mL，- HCH 20.0mL；滴滴涕中等浓度标准贮备液p,p/-DDE 2.00mL，o,p/-DDT 4.00mL，p,p/-DDD 2.00mL和p,p/-DDT 4.00mL，置于一只100mL棕色容量瓶中加异辛烷定容。此液则为6号混合标准工作液（见表2），并由此液逐步稀释后制得至少五种不同浓度的系列混合标准工作液，贮于暗处4左右保存不超过6个月。表2六六六、滴滴涕系列混合标准工作液的质量浓度标准工作液-HCH- HCH-HCH- HCHp,p/-DDEo,p/-DDTp,p/-DDDp,p/-DDT1号1.003.000.802.002.004.002.004.002号5.0015.04.0010.010.020.010.020.03号10.030.08.0020.020.040.020.040.04号25.075.020.050.050.010050.01005号50.015040.01001002001002006号10030080.0200200400200400注：六六六、滴滴涕标准溶液有毒性，需经浓氢氧化钾（KOH）或六价铬酸洗液浸泡后，才能洗涤。E.5 仪器、设备E.5.1 气相色谱仪：配备有电子捕获检测器和数据处理仪。E.5.2 色谱柱：玻璃填充柱：2m3mm，内装1.5OV17+2.0% QF1/GCQ孔径：149m177m (80100目)或1.6OV 176.4OV 210/Chromosorb W-HP孔径：149m177m (80100目)。毛细管色谱柱，弹性石英毛细管柱，CPSil 8 CB或SE54。柱长：25m或50m；内径：0.32mm或0.53mm；膜厚：0.25m。E.5.3 电动振荡器或超声波提取器。E.5.4 天平：感量1mg。E.5.5 三角烧瓶（具塞）：100mL。E.5.6 筒形漏斗：内径2cm，高5cm。E.5.7 容量瓶（棕色）：100、50、25、10mL。E.5.8 移液管：10、5、2、1mL。E.5.9 玻璃研钵：中型。E.5.10 层析柱：内径8mm10mm，长15mm20mm。上端带有一筒形漏斗贮液槽，容量为30mL左右。E.5.11 研磨机：带孔径为420m（40目）筛子。E.5.12 实验室常用仪器设备。E.5.13 载气：高纯氮99.99。E.6 采样和试样的制备E.6.1 采样：按：GB/T 14699.1的规定。E.6.2 试样制备：将送至实验室的平均样品，经四分法缩分至250g，用研磨机研碎，过孔径420m筛子，并装进密闭广口瓶中，在4左右避光保存备用。E.7 步骤E.7.1 气相色谱仪调试E.7.1.1 色谱条件（见表3）表 3柱型填充柱毛细管色谱柱检测器温度250300进样口温度230270柱箱温度210214分流比10：1载气流速（N2）60mL/min4 mL/min10 mL/min补充气（N2）20 mL/min25 mL/minE.7.1.2 仪器灵敏度检查进1号混合标准工作液（4.16）1.0L，应能分别读出8个峰的峰面积或峰高，并记