分子遗传7.doc

第七章原核生物转录调控1.举例说明一下操纵子包括结构基因和控制区以及调节基因的整个核苷酸序列叫做操纵子。就乳糖操纵子来说，从结构基因溯流而上而仅靠结构基因的部分叫做操纵子；它是调节基因阻遏蛋白的结合位点。2.lac乳糖操纵子的正负调控正调控：在乳糖存在同时葡萄糖缺乏的时候，CAP（CRP）结合在CAP位点上，从而激活RNA聚合酶结合在lac操纵子的启动子上，激活lac的表达。负调控：当环境中不存在乳糖是，lac抑制子基因表达成lac抑制子，lac抑制子以四聚体形式结合在lac操纵子的特异性位点，阻挡了RNA聚合酶结合在启动子上，进而阻挡lac基因的转录表达。3.CAP激活的分子机制葡萄糖降低细胞内小分子-cAMP的浓度，这一分子是CAP的变构因子：只有当CAP与cAMP形成复合物时，CAP蛋白才会形成结合DNA的构象。因此，只有当cAMP水平高（葡萄糖降低）时，CAP才会结合DNA，激活lac基因。CAP被RNA聚合酶的亚基的CTD识别。当RNA聚合酶与CAP相互作用时，CTD也在靠近CAP位点处与DNA接触，启动lac的表达。4.隐性突变（recessive），顺式显性突变，顺式-反式显性突变，显性失活突变隐性突变：突变发生在半乳糖苷酶或半乳糖苷透明质酸酶上，从而导致菌种不能在乳糖的诱导下启动lac的表达进而利用乳糖，导致乳糖在细胞内的积累。顺式显性突变：野生型等位基因为阻遏性状纯隐性时，在一对等位基因操纵子上的一个突变将突变细胞的额纯隐性性状转变为脱阻遏的显性性状。这种突变即为。顺式-反式显性突变：显性突变发生在二倍体不同对的等位基因上，导致诱导物不再能诱导lac的表达。显性失活突变：lac的抑制子基因发生突变，使得四聚体抑制子不能再结合到特异位点上从而导致的抑制失活性状。5.举例说明lacO是lac 1抑制子的靶位点Cohn的滤膜实验证明，组成型突变操纵子比野生型操纵子需要更多的抑制子来完成抑制子的全部结合到操纵子上，说明lac是lac 1抑制子的靶位点。6.举例说明RNA多聚酶在存在lac抑制子时和lac启动子形成开放式启动子复合物Lee and Goldfarb的实验表明在同时添加抑制子和诱导物的实验组中，放射性标记表明RNA的合成与同时不添加抑制子和诱导物的对照组中情况一样，而与只添加抑制子不添加诱导物的实验组不同。说明在诱导物的存在下，RNA多聚酶在即便存在lac抑制子时还能lac启动子形成开放式启动子复合物，启动转录的进行。细菌转录起始阶段，聚合酶与启动子初步结合形成闭合式复合体，尔后发生聚合酶结构变化、DNA解链最终形成开放式复合体。Lac抑制子结合lac操纵子时，阻止了RNA聚合酶在启动子上的结合和RNA合成的起始。细菌中，Lac抑制子只在乳糖缺乏的时候才结合DNA从而抑制转录，在乳糖存在时，抑制子没有活性。They incubated E. coli RNA polymerasewith DNA bearing an E. coli promoter known asthe lac UV5 promoter. Along with the polymerase andDNA, they included heparin, a negatively charged polysaccharidethat competes with DNA in binding tightly tofree RNA polymerase. The heparin prevented any reassociationbetween DNA and polymerase released at the endof a cycle of transcription. These workers also includedlabeled ATP in their assay to label the RNA products.Then they subjected the products to gel electrophoresis tomeasure their sizes. They found several very smalloligonucleotides, ranging in size from dimers to hexamers(26 nt long), as shown in Figure 6.12. The sequences ofthese oligonucleotides matched the sequence of the beginningof the expected transcript from the lacZ promoter.Moreover, when Carpousis and Gralla measured theamounts of these oligonucleotides and compared them tothe number of RNA polymerases, they found manyoligonucleotides per polymerase. Because the heparin inthe assay prevented free polymerase from reassociatingwith the DNA, this result implied that the polymerase wasmaking many small, abortive transcripts without everleaving the promoter. Thus, we see that transcription initiation is more complexthan first supposed. It is now commonly representedin four steps, as depicted in Figure 6.13: (1) formationof a closed promoter complex; (2) conversion of theclosed promoter complex to an open promoter complex;(3) polymerizing the first few nucleotides (up to 10) whilethe polymerase remains at the promoter; and (4) promoterclearance, in which the transcript becomes long enough toform a stable hybrid with the template strand. This helpsto stabilize the transcription complex, and the polymerasechanges to its elongation conformation, loses its -factor,and moves away from the promoter. In this section, wewill examine the initiation process in more detail.7.3端lac操纵子的结构和作用结构：在lac 1抑制子位点3端连着的是CAP激活子位点，其后面连着lac启动子序列。作用：CAP激活子位点是CAPcAMP复合体特异性结合位点，增强lac的表达。8.说明CAP激活lac操纵子在乳糖存在同时葡萄糖缺乏的时候，CAP结合在CAP位点上，从而激活RNA聚合酶结合在lac操纵子的启动子上，激活lac的表达。9.CAP参与DNA环化激活操纵子上的CAP位点有两个，一个在-35处，一个在-10处。CAP特异性结合在CAP位点上，当两个位点均被同一个CAP蛋白的同源二聚体结合上时， CAP蛋白半包围着DNA并诱导DNA产生巨大的弯曲环化，从而促使调节因子结合在RNA聚合酶上，促进转录的进行。1. mal调节子编码产生分解麦芽糖酶的基因，其特点是编码酶的基因与操纵子不同是间断不连续的，且基因是由多个启动子形成的复合启动子控制。2. malT和CAP协同作用malT在mal操纵子区域有多个结合位点，且相邻结合位点间间隔的碱基序列产生了一个3个碱基的重复，这样malT在特异性结合位点上可以产生3个碱基的滑动。在激活malKp启动子表达时，CAP结合在CAP特异性结合位点上，malT在原有的3、4、5结合位点上位移3个碱基结合在3、4和5上，从而正好使malKp启动子激活，启动下游基因的表达3. ara操纵子，ara操纵子的正负调控ara操纵子：编码阿拉伯糖酶基因的操纵子。ara操纵子的正调控：由AraC和CAP介导正调控。在有阿拉伯糖的存在，AraC与阿拉伯糖结合后复合物构象改变，结合在araI1及araI2上而非结合在araO2上，从而激活启动在区域，激活基因的转录。ara操纵子的负调控：由AraC介导负调控。在没有阿拉伯糖的情况下，araC表达AraC，AraC结合到araO2 和 araI1上，并通过二聚体的蛋白识别区域彼此结合，引起DNA环化，从而抑制启动子的激活，抑制基因的转录。4. ara操纵子的抑制环形成的证据把araO2ara序列区域与AraC共孵育，利用环化的DNA比线性的DNA电泳速度快的原理来鉴定经AraC孵育，DNA发生了环化现象。说明了AraC参与了DNA环化。利用阿拉伯糖的反复诱导证明了DNA的环化以及区环化是可以反复形成的。对ara的突变证明环化发生在araO2和ara上，与ara没关系。14.arac的自我调控不管阿拉伯糖存在与否，AraC在ara上的结合均阻止了转录长朝arac基因方向的进行，进而调控自身基因的表达。15.trp操纵子以及trp操纵子的衰减控制（Attenuation）trp操纵子：大肠杆菌中5个临近的trp基因编码了合成色氨酸的酶。这些基因的活性由抑制子控制。但是，控制抑制子活性的配体（色氨酸）不是一个诱导物，而是一个辅抑制子。衰减作用：当色氨酸缺乏时，Trp抑制子不结合其辅抑制子并退出其操纵子，允许trp mRNA从附近启动子起始合成。但是聚合酶起始了trp mRNA分子的合成却不总是将其全部转录。事实上，若没有第二个机制的支持，许多信使被提前终止甚至是在第一个trp基因之前就被终止了。这第二