2011秋现代仪器分析实验讲义合订本.doc

实验一 循环伏安（CV）实验一、 实验目的：掌握循环伏安法（CV）基本操作；掌握受扩散控制电化学过程的判别方法；了解可逆电化学过程及条件电极电位的测定；了解电化学化学偶联反应过程的循环伏安特点。并学会电化学工作站仪器的使用。二、 循环伏安法原理：扫描电压呈等腰三角形。如果前半部扫描(电压上升部分)为去极化剂在电极上被还原的阴极过程，则后半部扫描(电压下降部分)为还原产物重新被氧化的阳极过程。因此一次三角波扫描完成一个还原过程和氧化过程的循环，故称为循环伏安法。循环伏安法可用于研究化合物电极过程的机理、双电层、吸附现象和电极反应动力学成为最有用的电化学方法之一 三、 实验步骤1. 电极表面抛光2. 验证：亚铁氰化钾溶液中进行循环伏安扫描（电位差小于70mv）3. 电极连接，参数设定（起始电位、电位扫描范围、扫描速度等）4. 测定：峰电流随电位扫描速度的变化（处理在一张图上）； 5. 配制50mM铁氰化钾标准溶液，0.5 M的KCl溶液；6. 移取0.5、1、2.5、5mL铁氰化钾标准溶液至25mL容量瓶中，再加入5mLKCl溶液，配制成1、2、5、10mmol铁氰化钾标准溶液，固定扫描速率，控制一定的扫描速率测定峰电流随浓度的变化；7. 固定浓度，改变扫描速率（10、20、40、80、160mV/s），测定峰电流随扫描速率的变化四、 数据处理 1. 计算亚铁氰化钾的条件电极电位；2. 作出峰电流扫速v 1/2图，判断是否是扩散控制过程；3. 作出峰电流浓度工作曲线。实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量一. 实验目的1.学习荧光分析法的基本原理和LS55B发光分析仪的操作。2.学习同步荧光的操作，了解同步荧光的优点。二.实验原理荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。在一定光源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。酪氨酸(Tyr)、色氨酸（Try）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。三.实验仪器和试剂1. LS-55型发光谱仪;2. 移液枪(德国BRAND公司生产);3. 100ml容量瓶2支; 废液池（烧杯）一只；4. 氨基酸储备液：色氨酸20mg/l，苯丙氨酸20mg/l;5. 去离子水;四.实验步骤1打开电脑和光谱仪主机，将仪器预热20分钟左右。设定仪器参数：全波长预扫描参数，用储备液在100ml容量瓶中配置溶液，加水定溶后，使得色氨酸浓度为0.1mg/l, 苯丙氨酸1mg/l；对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果。同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。2从预扫描得到激发和发射波长的初步结果（200 600nm），分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。激发光谱参数：扫描波长范围200 - 350nm。(Phe)=287nm， 扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息；(Try)=357nm, 扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息。发射光谱参数：扫描波长范围200 - 400nm；ex（Phe）=206nm, 扫描速度=500 nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息；ex(Try)=217nm, 扫描速度=500 nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息记住取文件名。同步荧光光谱：扫描波长范围200-350nm, (-)（Phe）=81nm,扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息； (-)（Try）=140nm,扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm。（注意：由于物质的荧光性质受许多条件的影响，以上实验参数仅供参考，具体参数的选择视实际情况而定。）五数据处理1用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图（如图3、4）。2从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。图3. 苯丙氨酸荧光谱图苯丙氨酸扫描激发波长在206nm和260nm两处出现最高峰，本实验选择206nm为最大激发波长。此外，激发波长曲线在280300nm处出现了一个十分完美的峰，请注意，此峰由瑞利散射而产生，非激发波长峰（由于发射波长固定为287nm，因此激发波长曲线实际在200286nm之间。）图4. 色氨酸的荧光光谱图色氨酸扫描激发波长在217nm和277nm处有两个最大峰，本实验选择217nm固定为最大激发波长。六讨论与思考1对待测溶液进行预扫描的有何作用？2观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？3同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。4通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。 苯丙氨酸 色氨酸5比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。注意事项：1实验报告以电子版的形式在交作业专区跟帖子上传。也可书面提交。2实验结束后实验数据放置在网上可自己下载。实验三 透射及表面反射红外光谱法测定有机物一、 实验目的通过红外吸收光谱的测定，掌握Nicolet FT-IR的使用方法。二. 实验原理1 本实验用Nicolet FT-IR测定有机物以及高分子的红外吸收光谱。2 红外光谱作为“分子的指纹”广泛用于分子结构和物质化学组成的研究。根据分子对红外光吸收后得到谱带频率的位置、强度、形状以及吸收谱带和温度、聚集状态等的关系便可确定分子的空间构型，求出化学键的力常数、键长和键角。从光谱分析的角度看主要是利用特征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键，由特征吸收谱带频率的变化推测临近的基团或键，进而确定分子的化学结构，当然也可由特征吸收谱带强度的改变对混合物及化合物进行定量分析。3 对苯二酚的红外吸收谱图如上，可以看到在3500cm-1处有个大的吸收峰，这是羟基的吸收峰，3000 cm-1左右是C-H的吸收峰，1500 cm-1是C=C的吸收峰。三. 实验仪器和试剂1. Nicolet FT-IR傅立叶红外光谱仪（美国热点公司）;2. 压片机（美国热点公司）;3. 多功能反射头（美国热点公司）4. 对苯二酚5. 聚苯乙烯薄膜；6. 自备样品（塑料）;7. KBr固体四. 实验内容图 16 CO2分子的反对称伸缩振动(分辨率1和4 cm-1) 2260 2280 2300 2320 2340 2360 2380 Wavenumbers (cm-1)Single BeamR枝P枝1. 空气中CO2的测定（1）实验步骤：不放样品的情况下测试空气中的红外吸收谱图，在不扣除背景的情况下在nm下可以看到CO2的红外吸收谱图，在分辨率为4cm-1和1cm-1两种情况下分别测试。（2）分析两种分辨率下的谱图的异同。观察CO2的红外吸收精细结构。2. 邻苯二酚的测定（1）压片：将少量邻苯二酚固体加入到KBr粉末中，碾碎并拌匀，用压片机压成薄片。（2）测试：将压好的样品薄片放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。（3）谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能团指出来。3. 聚苯乙烯薄膜的测定（1）测试：将聚苯乙烯薄膜放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。（3）谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能团指出来。4. 自备样品（塑料）的测定（1）红外吸收谱图的测定：测试：将自备塑料样品放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看自己测得的是何种物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能团指出来。（2）反射红外谱图的测定：测试：将自备塑料样品放置在多功能反射头上，仔细小心的旋转压力，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看自己测得的是何种物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能团指出来。 注意事项：实验报告以电子版的形式在BBS上跟帖上交。也可书面提交。实验结束后实验数据放置在网上可自己下载。实验四 激光拉曼光谱的测定一. 实验目的1、了解拉曼光谱的基本原理，掌握显微共焦激光拉曼光谱仪的使用方法。2、测量一些常规物质和复杂样品的拉曼光谱。二. 实验原理 当用波长比试样粒径小得多的频率为的单色光照射气体、液体或透明试样时，大部分的光会按原来的方向透射，而一小部分则按不同的角度散射开来，产生散射光。散射光中除了存在入射光频率外，还观察到频率为的新成分，这种频率发生改变的现象就被称为拉曼效应。即为瑞利散射，频率+称为拉曼散射的斯托克斯线，频率为-的称为反斯托克斯线。通常称为拉曼频移，多用散射光波长的倒数表示，计算公式为 式中，和0分别为散射光和入射光的波长。的单位为cm-1。由于拉曼谱线的数目、频移、强度直接与分子振动或转动能级有关。因此，研究拉曼光谱可以提供物质结构的有关信息。自从激光问世以来，拉曼光谱的研究取得了长足进展，已广泛应用于物理、化学、生物以及生命科学等研究领域。CCD检测器光栅狭缝双瑞利滤光片显微镜样品扩束器激光图1显微共焦激光拉曼光谱仪结构 三、实验仪器和试剂1. 显微共焦激光拉曼光谱仪 Renishaw inVia（英国雷尼绍公司）2. 粉碎机、载玻片、盖玻片、胶头滴管3. 测试样品常规物质：CCl4，CH2Cl2复杂样品：不同淀粉类作物自备样品：不同材料的小挂件四.实验步骤1. 打开主机和计算机电源，同时打开激光器后面的总电源开关，将仪器预热20分钟左右。2. 自检. 静态取谱（Static），中心520 Raman Shift cm-1, Advanced - Pinhole 设为 in。使用硅片，用50 倍物镜，1 秒曝光时间，100%激光功率取谱。使用曲线拟合（Curve fit）命令检查峰位，检验仪器状态。3样品拉曼光谱的测定将样品放置在载玻片上,盖上盖玻片，置于显微镜的载物台上，调节显微镜载物台的高度使得显微镜能够清晰地观察到样品表面（上2，下1）。选择Measurement-New-Spectral acquisition进行实验条件设置，再将白光照明光路切换到激光照明光路（上1，下2），即选择激光照射，选择Measurement-Run运行实验，等待实验运行，直到窗口中出现红色的光谱曲线，采集光谱结束，保存扫描结果。五数据处理用仪器自带软件WiRE2.0或Excel绘制拉曼光谱。纵坐标是散射强度，可用任何单位表示，横坐标是拉曼位移，通常用相对于瑞利线的位移表示其数值，单位为波数cm-1。1纯物质的拉曼光谱（1）CCl4的拉曼光谱图图1 CCl4的拉曼光谱图（2）CH2Cl2的拉曼光谱图 图2 CH2Cl2的拉曼光谱图2.不同淀粉类作物的拉曼光谱图3 泰国香米的拉曼光谱图图4 荞麦的拉曼光谱图六、讨论与思考：1. 比较红外光谱与拉曼光谱的异同。2. 一般的拉曼散射有斯托克斯线和反斯托克斯线两种，为什么实验中记录的拉曼光谱常取斯托克斯线？3. 试分析常规物质（CCl4、CH2Cl2）的特征拉曼光谱。4. 拉曼光谱的发展及应用。注意事项：实验报告以电子版的形式在BBS上跟帖上交。也可书面提交。实验结束后实验数据放置在网上可自己下载。实验五 气相色谱-质谱（GC-MS）分离分析苯系物一、实验目的（1）了解气相色谱-质谱联用仪的基本构造，熟悉工作站软件的使用；（2）了解运用GC-MS仪分析简单样品的基本过程。二、实验原理 气相色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中的分配系数不同，使不同化合物从色谱柱流出的时间不同，达到分离化合物的目的。质谱法是利用带电粒子在磁场或电场中的运动规律，按其质荷比（m/z）实现分离分析，测定离子质量及强度分布。它可以给出化合物的分子量、元素组成、分子式和分子结构信息，具有定性专属性、灵敏度高、检测快速等特点。气相色谱-质谱联用仪兼备了色谱的高分离能力和质谱的强定性能力，可以把气相色谱理解为质谱的进样系统，把质谱理解为气相色谱的检测器。气相色谱-质谱联用仪的基本构成为：信号处理器进样系统离子源真空系统质量分析器检测器GC / DI样品本实验中待分析样品为苯系物，各组成物质的沸点见表1.混合样品经GC分离成一个一个单一组份，并进入离子源，在离子源样品分子被电离成离子，离子经过质量分析器之后即按m/z顺序排列成谱。经检测器检测后得到质谱，计算机采集并储存质谱，经过适当处理可得到样品的色谱图、质谱图等。 表1 甲醇和苯系物沸点甲醇苯甲苯二甲苯沸点()64.880110.8144三、仪器和试剂：（1）Agilent 6890-5973N GC-MS仪（安捷伦科技有限公司）；（2）HP-5 MS 色谱柱；（3）0-5mL移液器 (Transferpette, 德国BRAND 公司)；（4）0.45m的有机相微孔膜过滤器；（5）苯、甲苯、二甲苯（分析纯），甲醇（色谱纯）；（6）容量瓶四、实验内容与步骤：1） 分别用移液器取1ml苯、甲苯、二甲苯混合后，用甲醇稀释1000倍后待用；2） 用移液器取2ml稀释液，使用0.45m的有机相微孔膜过滤器后，转移至标准样品瓶中待测；3） 设定好GC-MS操作参数后，可进样分析：4） 设置样品信息及数据文件保存路径后，按下“Start run”键，待“Pre-run”结束，系统提示可以进样时，使用10l进样针准确吸取1l样品溶液（不能有气泡）。将进样针插入进样口底部，快速推出溶液并迅速拔出进样针，然后按下色谱仪操作面板上的“start”按钮，分析开始。五、色谱条件 进样口温度：250； 质谱离子源温度：230；色质传输线温度：250； 质谱四极杆温度：150；柱温： 载气流速： 0.5mlmin-1； 进样量：1l； 分流比：20:1。溶剂延迟：2分钟六、数据处理1） 对得到的总离子流色谱图（TIC），在不同保留时间处双击鼠标右键得相应的质谱图；2） 在质谱图中，双击鼠标右键，得到相应的匹配物质，根据匹配度可对各峰定性；3） 列出所有的物质，并结合其他知识确定各峰所对应的具体物质名称；4） 绘制样品的总离子流色谱图，给出色谱峰定性结果（含质谱检索结果、物质名称、保留时间）七、思考题1GC-MS仪是如何得到总离子流色谱的？除此之外，使用GC-MSD，我们还能获得哪几种色谱图，它们各有什么特点？2绘制某一保留时间处苯、甲苯的质谱图，分析它们主要产生了哪些离子峰。查阅质谱电离过程中分子碎裂的机理，写出苯、甲苯可能的分子碎裂过程。3解释：溶剂延迟（Solvent Delay）、分流比。4气相色谱适用于分析哪些样品，请举例说明。注意事项2） 清洗容量瓶、标准样品瓶时不要使用清洁剂；3） 如果是一天的第一个样，请先把仪器跑一个空针；4） 待测样一定要经过微孔过滤膜过滤；5） 进样时不能有气泡；6） 进样时要快，不要使进样针在进样口里停留太久。实验六 高效液相色谱(HPLC)柱效测定一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：R 2t(R2)-t(R1) /1.7*(W1W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。表1色谱柱测试条件出峰次序样品组成1邻苯二甲酸二甲酯（DMP）2邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3邻苯二甲酸二丁酯(DBP)如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。三.仪器与试剂1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：30，甲醇：70检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：100l定量环，实际注射每次可控制在200l。2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。3、色谱测定(1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。(2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。(4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。五.实验结果（1）流动相的比例为：高纯水：20%甲醇：80%，流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；（2）流动相的比例为：高纯水：30% 甲醇：70%；流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；（3）流动相的比例为：高纯水：20，甲醇：80，流速为0.5ml/min，记录色谱图，并计算分离度；（4）定性过程（混合物和DBP）：实验得到如下的色谱图下：六. 思考题（1） 比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形较好。但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？图2 缓冲液作流动相得出的色谱图图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？（3） 请分析实验结束后，怎样清洗柱子。分为两种情况，第一种情况为流动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、出峰时间的影响及流速对分离度的影响。实验七 液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解LC-MS的主要构造和基本原理；2、学习LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。二、实验原理1、液质基本原理及模式介绍液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS已经成为最重要研究方法之一。质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（Q1 = 100-259m/z）（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例：（Q1 = 259m/z）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：质量分析器），由于多了Q2、Q3的存在，在分析测试的模式上又多了四种选择：（三）子离子扫描模式（Product Scan）：第一个质量分析器固定扫描电压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。主要用于化合物结构分析。实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 100-259m/z）（四）母离子扫描模式（Precursor Scan）：第一个质量分析器扫描电压选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。主要用于同系物的分析。实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 259m/z）（五）中性丢失扫描模式（Neutral Loss）：第一个质量分析器扫描所有离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数15、18、45）的离子对，得到中性碎片谱。主要用于中性碎片的分析。实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 82-282m/z）（六）多反应监测模式（MRM）：第一个质量分析器选择一个（或多个）特征离子，经过碰撞解离，到达第二个质量分析器再进行选择离子检测，只有符合特定条件的离子才能被检测到，因为是两次选择，比单四极质量分析器的SIM方式选择性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高。主要用于定量分析。实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 138m/z）2、实验内容简介邻苯二甲酸酯(简称PAEs)是一类重要的环境内分泌干扰物，常被用作塑料的增塑剂，也可用作农药载体。近年来，随着工业生产和塑料制品的广泛使用，邻苯二甲酸酯不断进入环境，普遍存在于土壤、底泥、大气、水体和生物体等环境样品中，成为环境中无所不在的污染物。据报道，邻苯二甲酸酯类具有较弱的环境雌激素成分，具有影响生物体内分泌和导致癌细胞增殖的作用。环境内分泌干扰物是指能改变机体内分泌功能，并对机体、后代或（亚）种群产生有害效应的环境物质。由于环境内分泌干扰物对人和动物有种种不良影响，对环境内分泌干扰物的研究已成为国际关注的焦点。我国也正在逐渐重视有关环境内分泌干扰物的研究。三、仪器与试剂1、仪器液相系统：Varian Pro Star；自动进样器：Varian 410自动进样器；质谱仪：Varian 310 LC-MS/MS三重四极杆质谱仪（ESI离子源）；色谱柱：Varian Inertsil 3 ODS-3（150mm2mm，3m）。2、试剂甲醇：HPLC色谱纯；超纯水：Millipore Express超纯水系统制备；标准溶液：用甲醇配制邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)混合标准溶液（0.1ppm）。四、实验步骤1、条件设置色谱条件：流动相（90%甲醇+10%水）；流速（0.2ml/min）；扫描时间（7min）；离子源模式：电喷雾电离（ESI），正离子模式；扫描条件：Detector：1000V；Needle：5000V；Shield：600V；Spray Chamber Temperature：50；Nebulizing Gas Pressure：55psi；Drying Gas Pressure：18psi，Drying Gas Temperature ()：250，Capilary Voltage 30(V)，Coll.Energy 30(v)；质量分析器：三重四极杆；进样体积：10ul。2、实验测定按实验操作规程完成仪器开机、参数设置及测定。根据表1中的数据，设置m/z，选择各种扫描模式（全扫描、选择离子扫描、子离子扫描、母离子扫描、多反应监测模式）进行测定。表1 待测物质的母离子和主要子离子DMPDEPDBP母离子（m/z）195.1223.1279.1子离子（m/z）163.1149.1149.1五、思考题1、各扫描模式中m/z分别如何设定？2、比较各模式的测定结果，讨论各模式在测定中的作用。3、结合HPLC等其它色谱分析技术及实验，讨论LC-MS的优势及在社会中所能起到的作用。4、若作为开放实验，你认为本实验方法还有哪些方面可以补充或提高的？并建议通过化学实验教学中心论坛/bbs 与指导教师进行沟通，提出开放实验方案。 实验八 全自动顶空气相色谱法建立木材指纹图谱第一部分：实验原理 1 顶空分析技术原理 顶空技术主要用于分析固体或液体顶部蒸汽相中的有机挥发性物质，而气相色谱适用于分析挥发性和半挥发性的化合物，所以顶空技术是一种非常适合与气相色谱进行联用的分析方法。同济大学化学实验教学中心拥有一套完整的带有瑞士CTC公司combipal型带顶空装置的三合一自动进样器装置的Varian 3900气相色谱仪。 顶空分析技术就是气体萃取技术，常常用于气相色谱分析。对于样品中衡量高挥发性物质的分析测定，可以使用气体萃取的方法，因为气体是挥发性物质最理想的溶剂。顶空分析法通常可分为三类：静态顶空分析; 动态顶空分析和顶空- 固相微萃取。他们具有以下特点：操作简单；可以自动化；可变因素多；灵敏度高。 静态顶空分析是在一个密闭的容器中，其中的样品与样品上方气体达到平衡，直接抽取样品上方气体进行分析测试的技术，常被认为“一步气体萃取” 。静态顶空顶空分析原理的示意图见图1。图1 静态顶空分析法原理示意图 静态顶空分析法在仪器模式上可以分为三类：顶空气体直接进样模式、平衡加压采样模式和加压定容采样进样模式。本实验采用的是顶空气体直接进样模式，故重点讨论这种模式。顶空气体直接进样系统配有气密性的气体取样针,一般在气体取样针的外部套有温度控制装置。静态顶空分析气体直接进样可以分为两步：首先，将液体样品或者固体样品放在一个密闭的玻璃样品瓶中，并保持样品瓶中的样品上方留有一半以上的气体空间，在一恒定的温度下使两相达到平衡；然后，使用气密性注射器等份抽取样品瓶中的顶空气体直接注入到色谱仪注入口中进行色谱分离和测定。这种静态顶空分析法模式具有适用性广和易于清洗的特点,适合于香精香料、苯系物、香水、烟草和香樟树等挥发性样品含量较大的样品。静态顶空分析法的主要缺点是有时必须进行大体积的气体进样,这样挥发性物质的色谱峰的初始展宽较大会影响色谱的分离效能；另外进行定量测定也比较繁杂，必须考虑样品基体的干扰。 化学实验教学中心全自动顶空-气相色谱分析系统由全自动顶空气体采集器气相色谱仪和火焰离子化检测器组成。在顶空分析技术中，萃取过程可以分为两个步骤：第一，被分析组分从液相中先扩散穿透到气相中；第二，被分析组分从气相转移到萃取固定相中。这种改型可以避免萃取固定相受到某些样品基质中高分子物质和不挥发性物质的污染。在该萃取过程中，步骤二的萃取速度总体上远远大于步骤一的扩散速度，所以步骤一成为萃取的控制步骤。因此挥发性组分比半挥发性组分有着快得多的萃取速度。实际上对于挥发性组分而言，在相同的样品混匀条件下，顶空萃取的平衡时间远远小于直接萃取平衡时间。为了能够得到良好的重现性和有效的色谱分离,必须对样品的制备、温度和平衡时间、衍生化法、顶空气体的采集和传输等有关参数进行考察。 顶空-气相色谱分析的应用实例： (1)生物样本中挥发性有机物的测定，如香樟树色谱指纹图谱的建立； (2)药品中有机溶剂残留的测定； (3)有机聚合材料中挥发性有机物的分析，如苯系物的分离测定； (4)环境分析； (5)挥发油分析；(6)烟草行业的应用2 指纹图谱含义指纹图谱是指将研究对象经过适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的共有峰的色谱图或者光谱图等。形象地讲，木材指纹图谱就是木材的身份证，该木材的主要化学信息都能体现在指纹图谱上，指纹图谱使木材一材一图，决不混淆。指纹图谱具有模糊性和整体性等特点。从分子水平研究木材的化学成分，进而建立木材的指纹图谱具有重要的理论意义和实际需要。建立好木材的指纹图谱，就可以进行木材识别。要把识别技术建立在研究清楚每个内含成分的基础上，很不现实。这就要求，在尚不清楚全体化学成分的情况下，实现对物质群整体的控制。而现代色谱、光谱、波谱、质谱等仪器分析所得物质群指纹图谱，展现了这种可能性。几个物质群在相同仪器、相同试验条件、相同操作方法下所得的指纹图谱相同性，即可反映这些物质群的同属性。虽然对图谱中每个特定峰的成分并不了解，也即对物质群的化学成分并不全知晓，但这并不影响对物质群一致性的判断。以香樟木为例，设定以下实验条件：进样口温度为230； 进样体积为400 L；进样针温度为100 ；振荡器温度为80 ；振荡器加热时间为10min；检测器温度为260 。柱温升温程序：起始温度60，保持0.5分钟后以每分钟20的升温速率升至100 ，保持3分钟后以每分钟6的升温速率升至180 ，保持0.5分钟后以每分钟10的升温速率升至200 。在以上实验条件下，得到其色谱总离子流图谱如图2所示。 图2 香樟色谱指纹图谱3 模式识别与主成分分析原理 用不同的木材标准样品按照优化后的色谱条件进行实验后，在计算机系统里保存各木材标准样品的色谱指纹图谱数据。用同样的色谱方法对待检验木材样本进行检测，然后将获得的色谱图数据与标准库进行对比，就可以判定待检验样本属于哪类木材样本，从而实现模式识别。模式识别是指对表征事物或现象的各种形式的(数值的、文字的和逻辑关系的)信息进行处理和分析,以对事物或现象进行描述、辨认、分类和解释的过程,是信息科学和人工智能的重要组成部分。模式识别方法很多。在本实验中，主要采用统计模式识别。统计模式识别的基本原理是：有相似性的样本在模式空间中互相接近，并形成“集团”，即“物以类聚”。其分析方法是根据模式所测得的特征向量Xi=(xi1,xi2,xid)T(i=1,2,N)，将一个给定的模式归入C个类1,2,c中，然后根据模式之间的距离函数来判别分类。其中，T表示转置；N为样本点数；d为样本特征数。统计模式识别的主要方法有：判别函数法，k近邻分类法，非线性映射法，特征分析法，主成分分析法等。本实验主要采用主成分分析法来对木材进行模式识别。 简要介绍一下主成分分析方法。分析手段的仪器化和化学体系的复杂化已成为现代分析化学学科的两大重要特征。与其同时，化学计量学也迅速发展起来。从现代化学计量学的观点看，仪器分析数据的传统处理方法“如对光谱、波谱只取其峰值，对色谱只计算其面积等，这样做的后果只能造成大量有用信息的浪费。面对形形色色的多组份体系，在充分利用化学量测仪器所产生的化学信号特点的基础上，化学计量学运用统计学和应用数学及计算机，最大限度地从中抽取不同特性样本中的定性、定量化学信息。色谱联用技术的实验结果常用多种指标来表征，如果希望综合使用这些指标，就可以通过主成分分析方法把数据的维数降低。主成分分析在尽量不损失数据中的信息的前提下进行，其目的是从原始的多个变量取若干变量进行线性组合，以尽可能多地保留原始变量中的信息，新变量互不相关即正交。本实验中，对所获得的待检验样本色谱图数据进行主成分分析，然后进行主成分分析投影，根据物以类聚的原则，相似的物质聚集在相邻的区域。如果将数据库中标准样品和待检验样品的色谱数据综合处理，则可以将待检验样本与标准样品进行聚类分析，从而实现待检验木材样品的模式识别。 聚类分析是一种分类学与多元分析相结合的多元统计方法，它将分类对象置于一个多维空间中，按照空间关系的亲疏程度进行分类，即根据事物彼此不同的属性进行辨认，将具有相似属性的事物聚为一类，使同一类的事物具有高度的相似性。本质上，聚类分析是按“物以类聚”的原则将特性相近的变量或观察单位进行分类。聚类分析是一种探索性的分析。聚类分析可以分为层次聚类分析和快速聚类分析。层次聚类分析中根据聚类的对象不同分成Q型聚类和R型聚类。Q型聚类是针对样本进行聚类，它使具有相似特性的样本聚集在一起，使差异性大的样本分离开来；R型聚类是对变量进行聚类，它使具有相似性的变量聚集在一起，差异性大的变量分离开来，实现减少变量个数。快速聚类分析主要用于样本量过多或异常庞大的情况。在本实验中，利用excell的相关功能对获得的各待检验样本色谱图数据进行对齐各样本的保留时间等预处理，然后计算各待检验样本色谱图峰面积与标准样品峰面积之间的相关系数。相关系数越高，说明两种物质化学性质越相似，类别越相近；反之，则表明类别关系越远。4 数据处理 首先要结合线性代数知识，理解所获得色谱图的数据构成和所代表的化学意义。 简要介绍用Metlab编程语言如何进行主成分分析法投影分类。实施该算法的具体步骤是，将待检验样品量测所得数据矩阵（设为Y）进行一定的预处理，然后导入Metlab工作环境中，输入命令U，S，V=svd(Y) 进行奇异值分解，取U矩阵中的前两列矢量分别作为第一主成份（横轴）和第二主成分（纵轴），作二维平面图，即可以直观地观察到各个待检验样本所处空间。图3为两种不同木材作了共5个批次的实验后运用主成分分析法投影后进行模式识别的结果。其中一种是两个香樟样本，为图中标号4，5处；另外一种是三个松树样本，为图中标号1，2，3处。由图可知，分类效果明显。 图4 PCA投影用于树皮模式识别结果参考资料：1 王立 汪正范等 色谱分析样品预处理 化学工业出版社2 陈培容 李景虹 邓勃 现代仪器分析实验与技术 清华大学出版社3 许禄等化学计量学方法 北京 科学出版社 20044 宋国新等香气分析技术与实例 北京 化学工业出版社 20085 魏宁漪等。顶空进样和固相魏萃取进样鉴别掺伪麝香。中药材2004，27（1）8-106 冯建跃等。 聚类分析法研究化妆品的真伪。分析化学 1996.24（1）：104-1087 陈桦等。 中国白酒香型的化学模式识别-主成分分析与因子分析 食品科学200