嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2的结构与功能分析.doc

嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2的结构与功能分析【摘要】：金属硫蛋白(MTs)是细胞胞内金属结合蛋白超家族中的一员,几乎存在于所有生物体中,有较低的分子量(7000Da),分子内缺少芳香族氨基酸或组氨酸,并且能够通过半胱氨酸残基鳖合Zn、Cu或Cd等金属离子以达到解毒的目的。在哺乳动物体内MTs维持铜离子的动态平衡和清除自由基。金属硫蛋白根据物种种类被分为15个家族,四膜虫金属硫蛋白属于第7亚家族。嗜热四膜虫是第一个完成全基因组测序的纤毛类原生动物。目前,从嗜热四膜虫全基因组数据库分析发现其有5种金属硫蛋白基因：MTT1、MTT2、MTT3、MTT4和MTT5,然而它们编码蛋白的生理功能仍不清楚。为了了解不同MTs在四膜虫细胞内的功能,本课题以MTT1和MTT2为研究对象,首次对两种蛋白的结构和功能进行分析,获得结果如下：1MTT1和MTT2生物信息学分析MTT1基因编码162氨基酸的长链多肽,预测分子量为16.76kDa；而MTT2基因编码108氨基酸,预测分子量为11.17kDa,他们的分子量显著地高于其它高等真核生物。在Cys的排布模式上两者存在显著差别：MTT1主要包括Cys-Cys-Cys(CCC)和Cys-Cys(CC)结构,Cys排布方式与哺乳动物金属硫蛋白的a-domain相似；MTT2主要包括Cys-X-Cys(CXC)结构,Cys排布方式与哺乳动物金属硫蛋白的(3-domain相似。2MTT1和MTT2的表达分析通过实时定量PCR的方法分析了MTT1和MTT2在细胞对数生长期的表达,发现MTT2的表达量约是MTT1的32倍。同时观察了铜、镉、S02衍生物、高盐(NaCl)和饥饿初期等条件下二者表达的差异,MTT1能够被多种诱导物有效诱导表达,而MTT2对铜离子敏感。3MTT1和MTT2基因的克隆、突变和蛋白表达纯化通过PCR从四膜虫大核基因组克隆到MTT1和MTT2基因,通过定点突变将MTT1分子中的TAA和TAG突变为CAA和CAG,同时将MTT1和MTT2基因的N端突变：V4W(MTT1)和T3W(MTT2),然后将MTT1和MTT2连接pET28a表达载体构建重组表达质粒pET28a-MTT1和pET28a-MTT2,分别转化E.coliBL21(DE3)后经过1mMIPTG诱导表达,获得了MTT1和MTT2蛋白的包涵体,约占总蛋白的15-35%,包涵体溶解后经Ni2+亲和层析柱和Superdex75凝胶层析柱纯化得到目的蛋白。4MTT1和MTT2蛋白的分析利用荧光光谱研究MTT1和MTT2蛋白与二价重金属离子结合的特征发现,MTT1可以结合16个镉离子,MTT2可以结合11个镉离子；圆二色谱(CD)分析发现,MTs分子中半胱氨酸残基的排布形式影响着MTs与金属离子结合后的二级结构,带有独特“CCC”簇的MTT1和“CXC”簇的MTT2在结合镉离子之前二者蛋白质二级结构类似,均以无规则卷曲为主,而结合镉离子后Cd16-MTT1复合物中-螺旋和-转角占据优势,而Cd11-MTT2复合物却依然以无规则卷曲为主。5Cd16-MTT1和Cd11-MTT2的抗氧化能力将1mM的Cd16-MTT1和Cd11-MTT2复合物与低浓度NO(0.5mM)反应,经过傅里叶红外光谱扫描发现,有二硫键形成,证实了Cd16-MTT1和Cd11-MTT2复合物均具有抗氧化能力。6MTT1和MTT2的鳌合重金属能力利用紫外-可见光光谱对MTT1和MTT2结合第二副族(B)重金属离子的稳定常数进行了分析,MTT1和Cd2+结合有最大的稳定常数(KCd-MTTI=1.451020.45),和Hg2+结合的稳定常数次之(KHg-MTT1=2.471019.43),和Zn2+结合的稳定常数最小(KZn-MTT1=1.411016.60)；MTT2和Cd2+、Hg2+、Zn2+的稳定常数分别为KCd-MMT2=2.191018.10，KHg-MTT2=8.46107.79,KZn-MTT2=1.411010.98.在Cu2+滴定Cd16-MTT1和Cd11-MTT2复合物的过程中发现,Cu2+不能有效替换Cd16-MTT1复合物中的镉离子,而Cu2+却能够置换Cd11-MTT2复合物中的镉离子。7三价稀土元素La3+对MTT1和MTT2的影响La3+在低浓度时(小于80uM)能够促进嗜热四膜虫细胞繁殖,而高于这个浓度反而抑制细胞繁殖,超过100M后细胞破裂死亡；同时荧光光谱实验证实La3+可以进入四膜虫细胞；进入细胞内的La3+能够诱导MTTl和MTT2的表达,但MTTl的响应倍数(25倍)要高于MTT2(5倍)；荧光光谱实验也证实MTT1和MTT2蛋白可以与La3+发生结合反应以达到解除La3+毒性的作用。8MTT1和MTT2基因敲除细胞株的构建生物信息分析表明MTT1和MTT3串联排列,且Cys排列模式一致；MTT2和MTT4串联排列,Cys排列模式一致。为分析MTT1和MTT2在体内的功能,通过同源重组,构建了MTT1-MTT3和MTT2-MTT4基因敲除细胞株。相对于野生型细胞株,MTT1-MTT3基因敲除细胞株繁殖速度较快,且对Cd2+更加敏感；而MTT2-MTT4基因敲除细胞株繁殖速度变慢,对Cu2+更加敏感。本研究首次对具有不同一级结构特征的长链金属硫蛋白MTT1和MTT2进行了体外表达、纯化和光谱分析,证实MTT1被多种环境因素诱导并对镉离子具有强的亲和力。而Cu2+能够高效地诱导MTT2的表达并能够置换Cd11-MTT2中的Cd2+。说明金属硫蛋白中“CCC”簇与“CXC”簇的排布方式与离子结合存在一定的相关性,带“CCC”簇的MTT1更偏爱Cd2+,而Cu2+偏爱结合富含“CXC”簇的MTT2。因此,带有独特“CCC”簇的MTT1更多参与重金属离子的解毒,而带有“CXC”簇的MTT2可能主要参与生物体内Cu2+的代谢,进一步说明了不同MTs在细胞中执行不同的生理功能。本研究也首次证实了三价稀土元素La3+能促进四膜虫细胞繁殖,同时进入细胞并诱导MTTl和MTT2的表达,而MTT1和MTT2也可能通过天冬氨酸或谷氨酸上的O原子与La3+发生相互作用。MTTl和MTT2基因敲除实验进一步表明：两种不同的金属硫蛋白执行不同的生物学功能。【关键词】：金属硫蛋白嗜热四膜虫表达光谱分析稳定常数【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q75【目录】：中文摘要10-13ABSTRACT13-16缩略语表16-17第一章文献综述17-341.1金属硫蛋白概述17-201.1.1金属硫蛋白的基本特征及分类17-181.1.2经典金属硫蛋白的结构与表达调控18-201.2金属硫蛋白的生物学功能20-221.2.1参与体内微量元素代谢及拮抗重金属的毒性201.2.2清除自由基20-211.2.3参与各种胁迫反应211.2.4金属硫蛋白和疾病的相关性21-221.3四膜虫金属硫蛋白研究进展22-311.3.1四膜虫金属硫蛋白概述22-251.3.2四膜虫金属硫蛋白的进化25-271.3.3MTs基因的表达调控27-301.3.4MTs的应用30-311.4本项研究的目的和意义31-34第二章嗜热四膜虫金属硫蛋白的分析及MTT1和MTT2的克隆34-482.1材料34-352.1.1菌株及质粒342.1.2试剂及酶34-352.1.3主要试剂配制352.1.4主要仪器设备352.2方法35-402.2.1四膜虫细胞培养35-362.2.2四膜虫基因组的提取362.2.3MTT1和MTT2基因的克隆36-402.3结果40-462.3.1MTs中Cys的分布特点40-412.3.2四膜虫MTs在染色体上的位置41-422.3.3嗜热四膜虫MTs不同时期的表达42-432.3.4MTs中半胱氨酸排布特点分析43-442.3.5MTT1和MTT2基因的克隆44-462.4讨论46-48第三章四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2在不同胁迫条件下的表达分析48-673.1材料与仪器48-493.1.1细胞株483.1.2试剂及工具酶483.1.3主要仪器48-493.1.4主要试剂的配制493.2方法49-523.2.1四膜虫细胞培养493.2.2SO_2衍生物和NaCl对四膜虫繁殖的影响493.2.3La(3+)对四膜虫繁殖的影响493.2.4La(3+)进入嗜热四膜虫细胞实验493.2.5胁迫条件对四膜虫的处理49-503.2.6总RNA的提取50-513.2.7cDNA合成513.2.8RealtimePCR引物设计51-523.2.9基因表达分析523.3结果52-643.3.1NaCl对嗜热四膜虫繁殖速度的影响52-533.3.2SO_2衍生物对嗜热四膜虫繁殖速度的影响53-543.3.3La(3+)对嗜热四膜虫繁殖的影响543.3.4La(3+)能够进入四膜虫细胞54-563.3.5对数生长期金属硫蛋白MTT1和MTT2的表达56-593.3.6Cd(2+)和Cu(2+)对金属硫蛋白MTT1和MTT2表达的影响59-603.3.7NaCl对金属硫蛋白MTT1和MTT2表达的影响60-613.3.8短期饥饿对嗜热四膜虫MTT1和MTT2表达影响61-623.3.9SO_2衍生物对MTT1和MTT2表达的影响62-633.3.10La(3+)对嗜热四膜虫MTT1和MTT2的影响63-643.4讨论64-67第四章四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2的功能比较67-894.1材料67-694.1.1菌株及质粒674.1.2试剂及酶67-684.1.3主要试剂配制68-694.1.4主要仪器设备694.2方法69-754.2.1pET28a-MTT1和pET28a-MTT2表达质粒的构建69-704.2.2重组表达质粒pET28a-MTT1和pET28a-MTT2的鉴定704.2.3MTT1和MTT2的表达70-714.2.4MTT1和MTT2的纯化71-734.2.5MTT1和MTT2的荧光光谱分析734.2.6Cd_(16)-MTT1和Cd_(11)-MTT2的圆二色谱(CD)光谱分析73-744.2.7Cd_(16)-MTT1和Cd_(11)-MTT2抗氧化能力分析744.2.8MTT1和MTT2与B金属离子稳定常数测定744.2.9Cd_(16)-MTT1和Cd_(11)-MTT2与Cu(2+)的反应74-754.2.10MTT1和MTT2蛋白与La(3+)作用的荧光分析754.3结果75-874.3.1pET28a-MTT1和pET28a-MTT2表达质粒的构建754.3.2MTT1和MTT2基因的诱导表达纯化75-774.3.3MTT1和MTT2蛋白的纯化77-794.3.4MTT1和MTT2结合Cd(2+)的数目79-804.3.5Cd_(16)-MTT1和Cd_(11)-MTT2的二级结构分析80-814.3.6Cd_(16)-MTT1andCd_(11)-MTT2的抗氧化能力81-824.3.7MTT1和MTT2结合Cd(2+),Hg(2+)和Zn(2+)的稳定常数82-844.3.8Cd_(16)-MTT1和Cd_(11)-MTT2与Cu(2+)反应的动态分析84-864.3.9La(3+)与MTT1和MTT2相互作用研究86-874.4讨论87-89第五章MTT1和MTT2基因敲除细胞株的构建和鉴定89-1015.1材料与仪器89-905.1.1细胞株、菌株和质粒895.1.2试剂及工具酶895.1.3主要仪器895.1.4主要试剂的配制89-905.2方法90-945.2.1MTT1和MTT3基因侧翼序列的克隆90-915.2.2MTT1和MTT3基因敲除载体的构建91-925.2.3MTT2和MTT4敲除载体的构建925.2.4MTT1-MTT3和MTT2-MTT4嗜热四膜虫敲除株的构建92-945.2.5Cd(2+)与Cu(2+)对四膜虫敲