新型壳聚糖胶原微载体的制备和肝细胞培养.doc

新型壳聚糖/胶原微载体的制备和肝细胞培养吴旭波，黄芳，吴薇，余松林，王加祥，匡洁，施敏敏，蔡劬，韩宝三，彭承宏 上海交通大学医学院附属瑞金医院器官移植中心，上海市消化外科研究所，上海市瑞金二路197号瑞金医院科教楼10楼1019室 200025 摘要：本文应用壳聚糖与胶原作为原材料，利用高压静电将两者混合液滴入三聚磷酸钠（TPP）溶液中交联固化形成微球（200um左右）,经真空冷冻干燥后制成微载体。应用壳聚糖/胶原微载体培养L-O2肝细胞，L-O2肝细胞在微载体上具有良好的貼覆性，壳聚糖/胶原微载体对肝细胞功能的发挥和维持十分有利。 关键词：壳聚糖；微载体；肝细胞；细胞培养一、引言 体外肝细胞的高密度、高活性培养是“生物人工肝”系统的核心内容，微载体（microcarrier）培养肝细胞是近年来研究和应用较多的高密度悬浮培养肝细胞的理想方法之一，其较高的比表面积及面积/容积比可在有限的培养体积内黏附大量的肝细胞。微载体材料的生物相容性、与贴壁细胞的亲和性、微载体核心和表面的结构对细胞的生长和功能维持都有影响；具有良好生物相容性的生物可降解材料被认为是制备微载体的合适材料1。壳聚糖（chitosan）是自然界中唯一带正电的天然生物材料，且具有良好的生物亲和粘附性，无毒、可降解、几乎无过敏性等优点，近年来被广泛应用于组织工程支架材料的制作2-3；而胶原（collagen）更是体内细胞生长基质的重要成分，在体外有利于贴壁细胞的黏附。本文应用壳聚糖与胶原作为原材料，利用高压静电法一步制成微球，用于体外肝细胞培养。二、材料和方法1材料1.1 实验试剂 壳聚糖(Sigma)：低粘度（粘度200mPa.s，脱乙酰度：75%85%）；三聚磷酸盐(Sodium Tripolyphosphate，TPP；分子量：367.91，沪试）；含10小牛血清DMEM培养液(GIBCO)；细胞消化液(含0.05胰酶和0.02EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)；吖啶橙（AO，Sigma）；永生化的正常人肝细胞系L-O2（本实验室）。1.2 实验设备 高压静电微球发生仪(上海理工大学)；IX7型生物倒置显微镜(含荧光检测及照相系统)(Olympus)；真空冷冻干燥机（BENCHTOP）；扫描电镜（SEM，HITACHI，复旦大学医学院）。2方法2.1 鼠尾胶原的制备 取新鲜SD大鼠尾，生理盐水洗净后75%酒精浸泡消毒30min；将鼠尾剪成23cm的小段，再以75%酒精浸泡，30min后将鼠尾段剪开去掉皮毛，抽出银色的尾腱，称重。将鼠尾腱置于少许0.1消过毒的乙酸溶液中，剪碎尾腱，再加入一定量的0.1灭菌乙酸溶液（按每克尾腱加60ml 0.1%乙酸溶液的比例），4振荡 48小时；静置后取上层液体，4000转/分离心30min后，取上清，即得胶原蛋白溶液。胶原提纯：向上述胶原蛋白溶液中滴加0.1%NaOH液，至沉淀不再增加，1500转/分离心5min后见下层胶状物，弃上清，得到胶状胶原蛋白。可再加入0.1%乙酸溶液溶解胶原蛋白胶，根据加入乙酸液量的不同制备不同浓度的胶原。2.2 壳聚糖/胶原微载体的制备和形态表征 以1%的乙酸液配制浓度为2%的壳聚糖溶液，等量的鼠尾胶原蛋白胶与0.1%乙酸溶液配制成胶原蛋白液；再将上述两种液体以1：1的比例制备成壳聚糖/胶原混合液。充分混匀后，利用高压静电微球发生仪将壳聚糖/胶原混合液滴入3%的酸性TPP溶液，形成壳聚糖/胶原微球，大小控制在200um左右。微球继续交联1小时后，双蒸水清洗三次，每次10分钟， -80冷冻24h。冷冻后的样品进行真空冷冻干燥，制成壳聚糖/胶原混合材料的微载体。测定壳聚糖/胶原微载体的含水量和密度：取一定量的干微载体，称重W0，PBS液水化后滤纸吸去表面水份，称量湿性微载体的重量Wt，计算含水量的公式：含水量（Q）=(WtW0)/Wt100%；根据湿性微载体的质量和体积，计算微载体密度=m/v（m和v分别为湿性微载体的质量和体积)。重复3次实验，取其平均值。2.3 壳聚糖/胶原微载体肝细胞培养 将壳聚糖/胶原微载体浸于PBS液中过夜水化；水化后的微载体以75%酒精浸泡消毒1小时，并移入灭菌培养皿中；PBS液清洗3次，每次15分钟，在以DMEM高糖细胞培养液清洗一次，时间30分钟；酒精消毒及PBS液清洗同时均放置于紫外灯下辐射消毒。最后微载体于DMEM高糖细胞培养液中浸泡过夜，备用。取对数期生长的L-O2肝细胞5105个与壳聚糖/胶原微载体10mg置于未经表面处理的塑料培养皿中（细胞不贴壁），在37，5% CO2条件下共培养，每30分钟振荡一次，每次5分钟，4小时后每小时振荡一次，8小时后静止培养；不同时间观察细胞在微载体上的黏附生长情况。2.4 肝细胞在微载体上的生长形态观察 肝细胞微载体共培养后，于6h、12h、24h、36h、48h、72h在倒置显微镜下观察细胞在微载体上的贴覆和生长情况。并取部分微载体行吖啶橙（AO）染色：吖啶橙工作浓度为0.5mg/ml，避光15min，PBS液清洗后荧光显微镜下观察细胞在微载体上的生长情况。吖啶橙染色观察后的肝细胞微载体用2.5%的戊二醛固定，4保存电镜检测。2.5 肝细胞微载体培养的肝细胞功能评价 每24小时更换培养液，收集每天的培养上清液，应用全自动生化分析仪测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH），尿素（UREA）和白蛋白（ALB）含量，以了解肝细胞功能和代谢活性。三、结果1、壳聚糖/胶原微载体形态观察 2%壳聚糖与上述胶原蛋白液以1：1比例配制成混合溶液，制备的微球形态及大小控制较好，冷冻干燥后制成微载体，大小：200um左右，粒径分布较均匀。微载体表面有褶皱，微载体内部呈多孔结构，表面结构连续无孔（见图1）。微载体的密度平均为1.04g/ml，水化后含水率平均为93%。图1、壳聚糖胶原微载体电镜下形态（A：表面褶皱；B：内部多孔结构）2、壳聚糖/胶原微载体肝细胞培养生长形态观察壳聚糖/胶原微载体与L-O2肝细胞共培养4h后即可观察到肝细胞贴覆于微载体表面；吖啶橙（AO）染色后在荧光显微镜下观察，可以观察到肝细胞均匀地贴覆于微载体表面。至36小时，多数微载体表面已完全贴覆肝细胞，形成细胞贴覆的球形体特征，电镜检测可见肝细胞均匀覆盖于微载体表面（见图2）。3、肝细胞微载体培养的肝细胞功能壳聚糖/明胶微载体培养的肝细胞分泌白蛋白，合成尿素和LDH漏出量的变化趋势可见图3、图4、图5。可以看出肝细胞微载体培养后，培养液中LDH水平24小时内很快下降，并基本维持于一定水平，说明微载体培养对修复肝细胞膜功能十分有益；分泌白蛋白和合成尿素的能力在第3天就达到高点并维持一定时间，也说明微载体培养下，肝细胞功能可以得到较好地发挥和维持。图、微载体肝细胞培养生长形态（A：倒置显微镜；B：荧光显微镜；C：电镜）图、微载体L-O2肝细胞培养白蛋白分泌图、微载体L-O2肝细胞培养尿素合成图、微载体L-O2肝细胞培养漏出量四、讨论壳聚糖用于微载体制备，进行肝细胞培养的研究已有开展，研究 认为，壳聚糖膜表面大量氨基的存在可能对细胞的增殖有抑制作用，因此如何提高其生物相容性，使肝细胞更好地贴覆于微载体表面，更好地发挥肝细胞的各项代谢功能，成为当前研究的热点。研究人员通过在壳聚糖微载体表面交联、接枝其他材料的方法来提高肝细胞的黏附性能和代谢功能4-6。有研究表明壳聚糖与胶原可以任意比例混合，两者能很好的相容且具有较强的相互作用7。我们尝试将壳聚糖与胶原混合，利用TPP可以迅速与壳聚糖交联固化的特点8，一步法制备壳聚糖/胶原微球材料进行肝细胞培养，结果显示这种新型的壳聚糖/胶原微载体可以很好地被肝细胞黏附，并且在修复肝细胞膜损伤和发挥肝细胞代谢功能方面显示出其独特的优点。利用这一混合材料制成的微载体，还可以根据需要，在其表面引入新的活性基团或因子进行后续的改性处理，有利于细胞特异性黏附。当然，这一载体在稳定性及生物相容性方面还有待于进一步评价和改进。参考文献1 Kato D, Takeuchi M, Sakurai T, Furukawa S, Mizokami H, Sakata M, Hirayama C,Kunitake M. The design of polymer microcarrier surfaces for enhanced cell growth. Biomaterials, 2003, 24(23): 4253-4264.2 Wu C, Pan J, Bao Z, Yu Y. Fabrication and characterization of chitosan microcarrier for hepatocyte culture. J Mater Sci Mater Med, 2007, 18(11): 2211-2214.3 Li K, Wang Y, Miao Z, Xu D, Tang Y, Feng M. Chitosan/gelatin composite microcarrier for hepatocyte culture. Biotechnol Lett, 2004, 26(11):879-883.4 张立国, 潘继伦, 李结良, 俞耀庭. 果糖修饰壳聚糖微载体的制备及其原代大鼠肝细胞培养. 生物工程学报, 2003, 19(1): 116-119.5 张立国, 潘继伦, 李结良, 俞耀庭. 乳糖修饰壳聚糖微载体的制备及对培养肝细胞代谢活性的影响. 离子交换与吸附, 2004, 20(3): 231-236.6 郭丽, 王迎军, 任力, 冷云霞, 高前应, 葛坚. 明胶固定化改性壳聚糖膜的制备与性能表征. 功能材料, 2008, 39(11): 1929-1932.7 叶易春, 但卫华, 曾睿, 林海, 米贞健, 但年华, 关林波. 胶原与壳聚糖分子间的作用力. 高分子材料科学与工程, 2007, 23(5): 112-115.8 Mi FL, Shyu SS, Lee ST, Wong TB. Kinetic study of chitosan-tripo