固相微萃取-HPLC联用检测孔雀石绿.doc

材料科学与化学工程学院毕业(设计)论文 摘 要【摘要】本实验采用聚丙烯酸酯（PA）为萃取纤维,用固相微萃取法对孔雀石绿溶液进行了萃取。固相微萃取集进样、萃取、浓缩功能于一体，减少了溶剂使用量，操作简便，对样品有很强的富集作用,可以大大提高分析灵敏度。高效液相色谱的检测波长为595nm。实验结果表明，吸附时间为15min，解吸5min，在595m检测波长下，检测线性范围为0.1-2g/mL，检出限为0.003g/mL，此外，本实验还考察了pH值等条件对测定孔雀石绿的影响。采用SPME为萃取手段，是对孔雀石绿检测方法的一种创新，鲜有报道，为建立新的分析方法提供了一定的依据。【关键词】孔雀石绿；固相微萃取；高效液相色谱Abstract【ABSTRACT】In this paper,malachite green solution is extracted in solid phase micro-extraction method with polyacrylate (PA)which is extraction fiber.SPME brings sample collection, extraction, concentration functions into one procss, reducing solvent consumption and is easy operation.It has a very strong enrichment for samples and significantly improve the analytical sensitivity. HPLC detection wavelength is 595nm. The experimental results show that, extracted for 15min, desorpted for 5min, detected with 595nm wavelength, the linear range is from 0.1 to 2g/mL, the detection limit is 0.003g / ml. In addition, this study also examines impact on the determination of malachite green in experimental conditions such as PH value .Adoption of SPME for the extraction is an innovative detection of malachite green, which is rarely reported and provides a certain basis for the establishment of the new method.【KEYWORDS】Malachite Green；SPME；HPLC目 录摘 要IAbstractII目 录III1.前 言02实 验 部 分33. 结果与讨论54结论9参考文献9致 谢12II 第12页1. 前 言孔雀石绿C23H26N2是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料，又名严基块绿、孔雀绿、碱性绿，极易溶于水和乙醇1，以往仅在制陶业、纺织业、皮革业、食品着色剂、细胞化学染色剂和指示剂等方面有所使用。自1933年起孔雀石绿开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产养殖中出现，许多国家曾经采用孔雀石绿杀灭鱼类体内外寄生虫和鱼卵中的霉菌，对鱼类水霉病、原虫病等的控制2非常有效，而且操作方便，价格低廉。但研究发现：孔雀石绿是一种高毒素物质，其化学官能团三苯甲烷是一种致癌物质，并有高残留的作用，能在鱼体内长时间残留，通过食物链对哺乳动物和人类产生致畸、致癌、致突变3-6等作用，同时含孔雀石绿的养殖废水排放会污染水环境，其在鱼体内可迅速代谢为毒性更强的隐色孔雀石绿7,孔雀石绿和隐色孔雀石绿的分子结构如图1。为了有效地监控禁用药物孔雀石绿的使用，某些国家还规定了严格的检出限8。为预防孔雀石绿造成的严重影响，采用何种方法能够快速、简便、准确地检测水产品中的孔雀石绿含量已经迫在眉睫，更是当前学术界研究讨论的热点问题9。 图1. 孔雀石绿（MG）和隐色孔雀石绿（LMG）的分子结构目前孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测方法有高效液相色谱法10-15、高效液相色谱一串联质谱法 16-21、共振瑞利散射法22。我国于2006年发布有关的水产行业标准（SN/T1768-2006）23及国家标准（GB/T20361-2006）24。其中，付钰洁等25采用显微结晶方法，直接观察孔雀石绿及孔雀石绿分别与Zn2 +、C2O42 - 混合形成的特殊晶形,实现了简便、快速、直观的孔雀石绿定性检测。结合紫外分光光度法，对孔雀石绿溶液及孔雀石绿与Zn2 +、C2O42 -混合后的溶液作光谱扫描，通过对比孔雀石绿、Zn2 +、C2O42 - 和孔雀石绿与Zn2 +、C2O42-混合物的光谱扫描图,分析孔雀石绿与Zn2 +、C2O42-生成的新物质,验证了孔雀石绿的存在，此法可对孔雀石绿作定性定量的研究。张海琪等26建立了液相色谱串联质谱测定水产品中孔雀石绿及其代谢物残留的检测方法，能同时分离鉴定水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留，且重复性和准确性好，检出限为0.10g/kg，该法满足欧盟对水产品中孔雀石绿残留不得检出的要求。高效液相色谱法是当前测定孔雀石绿的公认方法，具有准确、灵敏等特点。本方法较目前现有的测定方法作了部分改进, 实现了无溶剂化，克服了传统的液-液萃取法需使用大量溶剂和样品、处理时间长、操作步骤多的缺点。吴仕辉等27将样品中的孔雀石绿、结晶紫经试剂盒提取，浓缩后用经固相萃取柱净化、硼氢化钾还原、反向色谱柱分离，使用高效液相色谱荧光检测器检测，成功地进行了水产品中孔雀石绿、结晶紫残留量的检测孔雀石绿、结晶紫的加标回收率在76.1%92.5%之间，相对标准偏差1.9%5.8%，检出限均为0.5g/kg。结果表明：该方法检测孔雀石绿（MG）、结晶紫（GV）处理简单，灵敏度高，节省时间，可用于大量样品的快速分析。该方法主要综合了各个方法标准中快速和灵敏这两个优点，相对于SN/T1768- 2006及文献13，14来说，检测限从2.0g/kg提高到了0.5g/kg，灵敏度与国标24及液质联用方法17相当（均为0.5g/kg），是水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留总量、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留总量快速而准确的检测方法。目前，应用SPMEHPLC联用测定孔雀石绿无文献报道，但关于其他物质的报道较多，如冯峰等28测定了除草剂苯噻草胺，胡彦学等29测定了番茄中氨基甲酸酯类农药残留，高常安等30测定了水中二苯并噻吩，杜新贞等31测定了水样中邻苯二羧酸脂化合物。本文采用聚丙烯酸酯（PA）为萃取纤维，用固相微萃取法对孔雀石绿溶液进行了萃取。固相微萃取集进样、萃取、浓缩功能于一体，减少了溶剂使用量，操作简便，对样品有很强的富集作用，可以大大提高分析灵敏度。实验结果表明，在15min萃取时间下，解析5min,在595nm检测波长下，检测线性范围为0.1-2g/mL，检出限为0.003g/mL。采用SPME为萃取手段，是对孔雀石绿检测方法的一种创新，鲜有报道，为建立新的分析方法提供了一定的依据。此外,本文中创新是将固相微萃取-高效液相色谱联用以及洗脱方法的选取。而通常固相微萃取与气相色谱的联用最普遍40-41。固相微萃取的装置类似于一个微型注射器，主要由手柄和萃取纤维头两部分构成，纤维头是一根1cm长、涂有不同高分子聚合物功能层的熔融石英纤维，装在类似于微量注射器的针管内，针管可以保护纤维头不易折断。平时萃取头收在针管内，萃取时针头穿过样品瓶中，压下管芯，使纤维头从针管中伸出，直接浸入溶液中(直接浸入方式)或置于易挥发样品的上部空间(顶空方式)，使萃取纤维暴露在样品中进行萃取，萃取吸附时间平均大约2030min，达到吸附平衡（常辅以磁力搅拌、超声波或微波等措施），再将萃取头收回到针管内，针管从样品瓶中退出。固相微萃取的选择性主要取决于高分子功能层材料的性能，不同的涂层对分析物的亲合力不同，按照“相似相溶”的原则，分析物容易被极性相似的固相萃取剂所萃取来选择合适的固相微萃取涂层。固相微萃取集进样、萃取、浓缩功能于一体，对样品有很强的富集作用，可以大大提高分析灵敏度。主要优点在于不用或少用溶剂，操作简便，携带方便。固相微萃取-高效液相色谱联用技术，除用于环境样品分析，应用范围已逐步发展到食品、医药卫生、生物化学、临床化学、生理及毒理学、法医学等领域，在国内也受到越来越多人士的重视，应用范围越来越广。固相微萃取-高效液相色谱联用目前主要有两种设计，一种是由Chen等人32提出的、采用传统的外表涂有涂层的纤维头，其固相微萃取-高效液相色谱联用界面包括一个六通进样阀和一个解吸池，样品萃取后，SPME纤维头浸入解吸池中用适当溶剂解吸，之后将阀切换至进样位置，用HPLC分析检测。另一种设计是由Eisert等人33提出的“intube-SPME” 这种设汁是将涂层涂在石英管的内表面，因此可采取气相色谱毛细管柱涂层的方法，并将气相色谱毛细管萃取柱放于HPLC自动进样阀和取样针之间用注射器吸入样品，当样品待测组分分配到毛细管内壁固定相上时，将阀切换至取样位置，以适当溶剂解吸后将解吸溶液转移到样品管中，再切换至进样位置，样品管内溶液随流动相进人高效液相色谱柱。这种设计的优点是涂层方便易得，种类多样；易于实现自动化，节省分析时间；比手动分析有更好的精密度。但是，这两种方式都需要一种特殊的解吸池或是固相微萃取-高效液相色谱联用接口，这就提高了对实验仪器的要求。我国农业部2004年颁布了水产品中MG残留量测定的行业标检验法液相色谱法(SC/T 30212004)34”；国家质量监督检疫总局和国家标准化管理委员会于2005年亦发布了“液相色谱串联质谱法”和“高效液相色谱法”(GB/T 19857 -2005)35的标准检验法；Cha ChangJun等”36报道了采用氰基柱的反相高效液相色谱法和液质联机检测孔雀石绿。在上述分析方法中，多采用C18柱。洗脱方式可以是等梯度洗脱(流速2mL/min)和梯度洗脱(流速lmL/min)。李立杰等37在研究这些分析方法的基础上，采用氰基柱分离、流速为1.0mL/ min的等梯度洗脱方式，保留时间短、分离效果好、分析速度快、节省试剂、精密度高，最低检测浓度隐色孔雀石绿为0.02 mg/L，孔雀石绿为0.05mg/L线性范围达0.1160.0 mg/L，远远大于SC/T30212004线性范围(孔雀石绿0.010.4mg/L；隐色孔雀石绿0.020.40mg /L)，而且，等梯度洗脱方式又扩大了液相色谱的应用范围。样品加标回收率65.8%一82%。这种在线洗脱方法需要特殊的洗脱装置，费用较高，本试验中采用了自制微量定量解吸装置，装置中事先加入40L乙腈-醋酸铵溶液，萃取头完全浸入溶液解吸后取出，用微量进样器抽出所有乙腈-醋酸铵解吸液，注入液相色谱中分析。采取此法，节省了购买洗脱装置的费用，节省了实验经费。选此课题，目的是建立一种新的快速、高效、准确的检测方法，从而有效拦截含有孔雀石绿的水产品流入市场或出口，避免危害广大人民群众身体健康，减少贸易摩擦。2实 验 部 分2. 1 药品和试剂MG (99%)，国药集团化学试剂有限公司，分析纯；醋酸铵，美国Tedia，分析纯；乙腈，HPLC级，购于Fisher 公司 (New Jersey，USA)；二次蒸馏水；其它各种溶剂或试剂均为分析纯。2. 2 仪器、器械和实验参数2.2.1 仪器岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司LC-10AT)，紫外检测器，25L微量进样器，N2000色谱工作站；Haier BCD205T型电冰箱。2.2.2 器械5mL萃取瓶;微型磁转子;移液枪（50-500L，5-50L）;固相微萃取装置(美国Supelco公司)，包括：萃取手柄、萃取操作台、5mL萃取瓶、微型磁转子，萃取头纤维涂层：聚二甲基硅氧烷(PDMS，100m)、聚丙烯酸脂（PA, 85m）；2.2.3 实验参数色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18(150mmx 4.6 mm，粒径5m)；流动相：乙腈醋酸铵；流速：1.0 mL/min；UVD 170U型紫外检测器：检测波长595 nm；进样体积：20.0 mL；2. 3样品的配制取1mL浓度为10g/mL的MG溶液，于容量瓶中稀释至100mL，稀释后浓度为0.1g/mL；取5 mL浓度为10g/mL的MG溶液，于容量瓶中稀释至50mL，稀释后浓度为1g/mL。溶液配好后立即放入冰箱保存，备用。取8 mL乙腈和2 mL醋酸铵，混合后用保鲜膜封住烧杯口，置于阴凉处，留做洗脱液和流动相。2.4 固相微萃取萃取技术定量依据由于固相微萃取萃取头体积小，决定了SPME固相微萃取不能完全萃取样品中的目标分析物，要进行定量分析，就要研究萃取头中目标分析物的萃取量(n)与其在样品中初始浓度(C0)间的关系。直接固相微萃取中，一定条件下分析物在样品基底和萃取头中达到分配平衡时，其在两相间的分配系数为Kfs=Cs/Caq (1)Cs和Caq分别为平衡时分析物在两相中的浓度。当系统达到平衡时，萃取头中所吸附的待测物质可由下式决定： n= KfsVfC0Vs/( KfsVf+ Vs) (2)式(2)中n为萃取头中所吸附的待测物质的量；Kfs为待测物在样品及萃取头间的分配系数；Vf为萃取涂层体积；C0为待测物初始浓度；Vs为样品体积。当样品体积时VsKfsVf ，式(2)可近似为： n= KfsVfC0 (3)可见，直接固相微萃取中，平衡时萃取头中目标分析物的萃取量与其在样品中的初始浓度呈线性关系，这是直接固相微萃取中定量分析的依据。同时，式(3)为固相微萃取的野外取样提供了理论依据，即可将萃取纤维置于自然环境中直接取样。因为萃取的目标分析物的量与样品的体积无关。当系统达到平衡时，萃取头中所吸附的待测物质可由萃取时间主要指的达到平衡时所需的时间，萃取的时间与待测组分的分配系数、扩散系数和萃取头有关。萃取过程一开始，吸附量迅速增加，而接近平衡时，速度变得非常缓慢。萃取时间越长，萃取效率越高。根据非平衡理论：在一定试验条件下，即使未达平衡时，萃取量与样品的初始浓度呈正比，所以在保证灵敏度的前提下，可以选取较短的萃取时间以缩短分析时间。固相微萃取实际萃取时间可由萃取时间和萃取量的吸附平衡曲线来决定。3. 结果与讨论3.1 固相微萃取萃取条件的优化3.11萃取纤维的选择新用的萃取头需要进行老化，使用前用流动相冲洗直至无干扰峰出现；而旧的萃取头每次使用前应该进行活化：用流动相冲洗20min。萃取前注意风干，避免有机溶剂的存在而影响萃取效率。将聚丙烯酸酯（PA）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取头在乙腈和醋酸铵比例为8：2的萃取剂中活化20min ，用流动相冲洗至无干扰峰出现，旧萃取头每次使用前用流动相冲洗20min,萃取前风干。萃取瓶中加入4mL 1g/mL的孔雀石绿溶液，加入微型瓷砖子，打开萃取操作台的电源，调节转速至液面有漩涡状态，转速为460rpm。将萃取纤维插入溶液中，萃取15min 。取出萃取手柄后进行色谱分析。比较不同极性的萃取头对MG的萃取效果,效果如图2。分析可知，PA 为极性物质，PDMS为非极性物质，根据相似相溶的原理，具有极性的MG与PA有较强的吸附作用。图2. PA和PDMS对MG的萃取效果对比3.1.2 解吸时间的优化按上述操作，将萃取头浸入1g/mL的孔雀石绿水溶液中吸附45min，在液相色谱上分别测定解吸3 min、5 min、7 min、9 min的样品，根据所得数据作峰高与解吸时间的关系曲线（图3）可看出，3-5min之间，解吸效率急剧增加，而5min以后，解吸效率变化得比较平缓，综合考虑解吸时间和解吸效率的关系，5min为最佳解吸时间。 图3. 不同解吸时间下的峰高3.1.3吸附时间的优化固相微萃取是一个基于待测物质在样品及萃取头中的平衡分配的萃取过程。取上述1g/mL孔雀石绿溶液，将PA萃取头浸入溶液中分别吸附5min、10min、25min、25min、35min、45min后，解吸5min，进样，测得结果见表2。根据所得数据作峰高与吸附时间的关系曲线，在5-45min范围内，孔雀石绿吸附量随吸附时间的增加而增加。试验显示萃取头吸附15min后，其解吸量完全可满足检测要求，故吸附时间选定15min。表2 不同吸附时间下的萃取效果吸附时间/min51015253545峰高783936.21015.412091343.81714.4 图4. 峰高与萃取时间的关系3.1.4 离子强度的选择在MG溶液中加入不同浓度的氯化钠，研究离子强度对MG萃取效率的影响。盐的加入，提高了溶液的极性，有利于纤维对吸附物的吸附。但在萃取过程中盐附着于萃取头上，影响试验的重现性且使萃取头易损坏。因此，在进行直接固相微萃取时，如果盐的增益不是很大，尽量不加盐。实验中向待萃取的孔雀石绿溶液加入NaCl，经过萃取后，萃取手柄上的萃取纤维头脱落。考虑到纤维头价格昂贵，以及后续实验仍要继续，故放弃对离子强度这一条件的考察。3.1.5 pH值的影响pH值可改变分析组分与试样介质、固定相之间的分配系数，从而影响萃取效率。孔雀石绿本身呈弱碱性。通过外加酸碱，可改变溶液的液pH，考虑到萃取瓶中加入的待萃取溶液的体积为4mL，故如果加入酸碱液体体积200L4mL，则体积改变为0.5%，可近似认为溶液体积前后并未发生变化。外加酸碱的选择，酸选择浓度为65%-68%的HNO3，碱选择氨水。通过计算，配置pH为3、4、5、6、7的待萃取溶液，吸附-解吸后检测，做峰高pH关系图。由图可知，pH=7时，峰高有最大值，说明在中性环境下萃取效果最好，故本实验无须外加酸碱，在中性环境中萃取。 图5. 不同pH条件下的峰高3.2 流动相组成的选择相关文献27中有报道，分别采用（1）乙腈+乙酸钠缓冲液（pH=4.5）=80+20；（2）乙腈+乙酸铵缓冲液（pH=4.5）=80+20为流动相进行检测，实验结果表明，用流动相（1）进行检测时基线噪音大，对检测结果有干扰，而用流动相（2）进行检测时基线噪音小，对检测基本无干扰。文献38中有报道，选择乙腈0.125 mol /L(pH=4.5)乙酸胺溶液作为流动相，实验结果表明，当乙腈含量超过80%时，峰形出现拖尾现象，当乙腈含量低于60%以下时，出峰保留时间太长39。因此选择乙腈+乙酸铵缓冲液（pH=4.5）=80+20为流动相进行检测，在此分离条件下，孔雀石绿峰形对称，柱效高。3.3 线性范围、检出限将10g/mL的MG溶液稀释至0.1g/mL、0.5g/mL、1g/mL、2g/mL，在优化的实验条件下，即萃取时间15min,解吸时间5min,在595nm处检测，用峰面积对浓度绘制标准曲线，得出本实验的定量线性范围和检出限、灵敏度。表3 不同浓度溶液出峰的峰高浓度/g/mL0.10.512峰高323961.71656.12616.7以HPLC测得的峰高y为纵坐标，相应的浓度x为横坐标绘制标准曲线，其线性关系为：y=319.66708+1188.56436x,该方法在孔雀石绿浓度范围在0.1一2.0g /mL时，R=0.99239，根据3倍信噪比计算，最低检测限为0.003g/mL。4结论 根据色谱分析结果，选择极性较强的PA作为萃取头。在15min萃取时间下，解吸5min,在595nm检测波长下，检测线性范围为0.1-2g/mL，检出限为0.003g/mL。参考文献1 翟毓秀，张翠，宁劲松，等水产品中孔雀石绿残留及其研究概况J海洋水产研究，2007，28(1)：101-1082 CULP S J，BELAND F AMalachite green：a toxicological reviewJAm Coll Toxicol，1996，15：219-2383 卢迈新美洲鳗对几种药物的敏感性研究J淡水渔业，2000，30(5)：28-294 Stammati Annalaura，Nebbia Carlo，Angelis Isabella De，et a1Effects of malachite green(MG)and its major metabolite，leucomalachite green(LMG)，in two human cell linesJToxicological in Vitro，2005，19(7)：853-8585 Srivastava Shivaji，Sinha Ranjana，Roy DToxicological effects of malachite greenJAquatic Toxicology，2004，66(3)：319-3296 Mittelstaedt R A，MeiNan，Webb Peggy J，et a1Geno toxicity of malachite green and leucomalachite green in female Big Blue miceJMutation Rese/Genetic Toxicology Environment Mutagenesis，2004，561(12)：1271387 Doerge D RMechanism for inhibition of thyroid peroxi2dase by leucomalaehite greenJChemlResl Toxicol，1998，11：109811048 桂英爱，王洪军，刘春林，刘中，丁勇孔雀石绿及其代谢产物在水产动物体内的残留、危害及检测研究进展田大连水产学院学报，2007，22(4)9 林谦，林炜，叶瑞洪.紫外可见分光光度法测定水产品中孔雀石绿含量. 福建师范大学福清分校学报，2009,94(5):60-6410 李连庆，张素青，李春青高效液相色谱(High-performance liquid chromaography)测定水产品中孔雀石绿及其代谢物的残留量的检测方法J现代渔业信息，2007，22(4)：2425、3011 叶四化，陆超华，谢海平，李娜高效液相色谱双波长法同时测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿J分析科学学报，2007，23(1)：69-7212 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会发布水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一高效液相色谱荧光检测S中国标准出版社，200613 任秀莲，魏琦峰，曲径，等反相高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物J中国卫生检验杂志, 2006,l6(8):939-940.14 林洪，付晓婷，邱绪建, 等液相色谱法测定鱼肌肉中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物J中国海洋大学学报, 2006, 36(6):909-912.15 Kamila Mitrowska, Andrzej Posyniak，Jan ZmudzkiDetermination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detectionJ. 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