HPLC-HPCE实验讲义与阅读思考材料.doc

实验课流程：1. 交预习报告，2. 签到，3. 基础知识介绍，预设问题4. 配溶液。5. 介绍仪器使用，6. 开始实验，7. 实验过程中不断提问，交流，交换实验。积极思考、探索实验中基本问题、主动使用程序、了解仪器原理的同学，在“预习提问”“基本操作”两栏（共40分）内给满分。循规蹈矩，按部就班的给25分。8. 问题排除，学生亲自编写method，9. 实验结束，清洗烧杯、容量瓶。10. 登记仪器使用情况。关闭仪器，打扫卫生。在成绩册上打分，老师在数据记录上签字后方可离开。实验记录要求：应包括目的、步骤、仪器型号、分离柱型号等。注意有效数字等。报告中可以讨论一两个实验课上的预设问题。完全按照书上回答的，在实验“报告”部分（共15份）给10分。有自己对实验问题的想法，即使科学性上有漏洞，给满分10分。HPLC法测定水溶液中扑热息痛含量一、教学目标：1. 认识HPLC的结构，熟悉HPLC操作2. 了解HPLC进行分离、定性、定量的方法。二、教学内容：1. 高效液相色谱（HPLC）仪器简介色谱分离的基本原理：组分在固定相与流动相中的分配系数不同。根据流动相不同，可以分为气相、液相色谱。液相色谱最为常见。有机合成实验中常使用常规尺寸的硅胶柱：分离量大、分离度低、分离速度慢、只能对部分物质做半定量。提高分离效率、稳定性和定性、定量能力的办法：减小颗粒尺寸和粒径分布，增加管长度、均匀地填充固定相。但这些措施往往增加柱传质阻力。因此发展出使用微米级颗粒为固定相材料、泵驱动液体流动进行分离的方法即高效液相色谱法。历史上有高压液相和高效液相之说。分析型色谱和制备型色谱的概念。我们主要学习分析型色谱。三、仪器组成：以我实验室分离二茂铁(Fc)标记的DNA溶液为例（上图右）。HPLC系统一般应包括：流动相、泵、进样阀、分离柱、检测器直至废液瓶等部分。溶液：可以是一种溶剂。或几种溶剂的固定配比。叫做“等度洗脱”。对于一些实验，往往需要两种以上溶剂并且连续调节流动相的配比，这叫“梯度洗脱”。梯度洗脱需要用两个以上的试剂瓶和两个泵。我们现有的两台HPLC，分别有一个和两个泵。今天的HPLC法测定水中扑热息痛含量实验将是一个等度洗脱的实验。所以两台仪器都符合实验要求。泵：由于传质阻力大，为达到快速分离，必须使用泵驱动液体。泵的种类：蠕动泵、螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵等。往复泵成为主流。如下图所示。螺旋注射泵 往复泵工作原理通道：100um管道，稳定性好，能减小死体积、使用流体量小。进样阀：通过采样环控制进样量。通常使用6通阀进行进样。其结构如下图：六通阀为上下两层结构，溶液通过两层上各6个小孔连通。可以通过转动控制采样环进入或离开流路。在“load”位置时，可以将样品打入采样环（图中4-6的管道）。当把阀转至“inject”位置时，样品被带入到流路中，形成一段“样品塞”。除了HPLC，很多流动进样的仪器都使用类似的六通阀进样，所以了解六通阀结构是必要的。因为样品是存放在采样环中，通过转动阀体进入流路。因此，和气相色谱不同，使用HPLC时不需要快速注射样品。进样针采样量也不要很准，在我们实验中，由于采样环为20mL，因此进样针吸取溶液超过20uL都可以。因为实际采样是依靠进样环控制的，多注入的样品被直接排入废液小瓶。注意不要打入气泡。把阀旋转至“inject”的时候也不用很快，推倒底就可以。如果不推到底，液体被堵在进样阀里，压力会升高，可能导致泵、阀损坏。分离柱：大多数固定相以多孔SiO2颗粒为基质，表面键和有机物或高分子材料。 如：C18柱就是以表面键和有十八(烷)基硅烷的SiO2颗粒作为固定相的分离柱。固定相颗粒越小，分离效果越好，同时所需压力越大。温度也是影响分离效率的一个因素，所以很多分离过程在柱温箱里进行能够更稳定或得到更好的分离里效果。我们实验中使用的是5 mm粒径的一种C18柱，属于中等粒径的分离柱。更小的粒径有3 mm等。我们的分离柱已经可以分离一些性质比较接近的生物分子如具有不同碱基个数的DNA等，算是比较好的分离柱了。检测器：我们使用的是最常用的紫外可见检测器。扑热息痛的最大吸收波长在254nm。高级的HPLC配有PDA（光电二极管阵列）检测器能同时给出物质光谱。预设提问，在实验中一起讨论，点名回答，计分。1：从HPLC最基本的原理讲，分离过程中流动相组成逐渐变化能够改变什么？告诉我们为什么梯度洗脱往往比等度洗脱效率高？（提示：从色谱基本原理出发） 2：HPLC中的泵应该具有什么样的性质才算是一台好的泵？3：流动相中进入颗粒状杂质会引起什么故障？怎样避免引入颗粒？4：微量进样器的使用还记得吗？如何驱除其中的气泡？5：什么是正向柱和反向柱？6：如果一个气泡进入色谱柱，对仪器是“致命”的损害吗？7：回忆HPLC检测器都可以是哪些？有什么特点？四、实验步骤做色谱实验不能急，应该带护目镜（我们实验室没有配备）。眼睛不要过分靠近仪器管路和接口处。应该带手套（我们实验室没有配备）.我只能纸上谈兵介绍实验室安全知识了。1） 分别移取0.25、0.50、1.00、2.5、5 mL扑热息痛stock溶液（100ug/mL）至50mL容量瓶，用二次水定容。配制成0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 ug/mL的扑热息痛标准溶液。注意溶液应倒在干净的烧杯中然后用移液管量取，烧杯和移液管在使用前都应用储备液荡洗。其他操作遵循“化学分析”实验要求。（在414室）2） 将配好的5瓶溶液、扑热息痛未知样品带回408实验室。同时带两个烧杯装洗微量注射器的废液。3） 检查流动相溶液是否充足，若溶液量少于200mL应在教师指导下更换流动相。设置HPLC参数，使流速为1mL/min，检测器工作波长为254nm，柱温为30 oC，将基线校正归零。打开紫外-可见检测器的光源。（老仪器所有参数设置均在仪器面板上，光源已经打开。新仪器所有参数设置均在软件界面内的“仪器状态”里。新仪器同时需要设置乙腈与水比例为20%：80%）。4） 检查所有设置的参数是否正确，开始进样分离过程。新老仪器开始进样分离的步骤略有不同：新仪器：点击“控制”中“单次运行”。在“方法”中检查应为“method/WK01”。设定保存路径为“E:/仪分/wk/当天日期（YY-mm-dd）/group1” （当天第二组使用仪器的改为group2）。样品名为，样品ID可根据实际样品命名，如：“1 ug injection 1st”，(当天第二组使用仪器的改为group2)之后点击“开始” 。此时软件会显示“正在平衡方法”，可利用此时间在盛放“HPLC专用乙腈”的小玻璃瓶中清洗微量注射器数次，尽量除去其中的气泡。之后在待注射样品溶液中多次清洗，除去可能残留的乙腈。吸取30uL样品，尽量避免吸入气泡。确认进样阀位置在“load”位置，待“正在平衡方法”变为“等待触发”后，将进样针轻轻插入进样孔，直至能感觉到到底后的阻力。将25uL样品推入进样器，由于采样环为20uL，多余的溶液会从一个出口流出，不必担心进样量前后不一致。如果“等待触发”已经出现而洗针尚未结束，不用理会。仪器会一直等待。每次进样前微量注射器都应该利用样品清洗几次，以保证浓度一致。乙腈清洗仅在第一次使用前和实验结束后才需要。每个浓度进两个样，误差应在5%以内。老仪器：在“参数设置”栏内填入样品名称，如：“1 ug injection 1st”，在“保存路径”内设定“E:/仪分/10仪分试验/王康/当天日期（YY-mm-dd）/group1” （当天第二组使用仪器的改为group2）。在盛放“HPLC专用乙腈”的小玻璃瓶中清洗微量注射器数次，尽量除去其中的气泡。之后在待注射样品溶液中多次清洗，除去可能残留的乙腈。吸取30uL样品，尽量避免吸入气泡。确认进样阀位置在“load”位置，将进样针轻轻插入进样孔，直至能感觉到到底后的阻力。将25uL样品推入进样器，然后立即点击“采集数据”（可以两人配合）。由于采样环为20uL，多注入的溶液会从一个出口流出，不必担心进样量前后不一致。老仪器每次进样前微量注射器都应该利用样品清洗几次，以保证浓度一致。乙腈清洗仅在第一次使用前和实验结束后才需要。每个浓度进两个样，误差应在5%以内。5） 数据分析处理。在样品峰出现后约1min时间后停止采集信息。先进行下一次进样（参照上一步）。在进样后等待出峰的时间内处理上一次的谱图数据。新仪器：点击“分析”/“分析”，之后点击“报告”/“面积百分比报告”，查找并记录样品对应的峰位置和峰面积。老仪器：点击“预览”，查找并记录样品对应的峰位置和峰面积。6） 重复4、5至标准溶液和样品全部测定完毕。7） 用乙腈清洗移液器数次。8） 利用校准曲线法对未知样中的扑热息痛进行定量分析。需要将数据在坐标纸上绘出。用高效毛细管电泳法测定样品中Cl-含量（教案）一、教学目标：1. 掌握电泳与电渗流概念，了解其在毛细管电泳分离过程中起到的作用2. 掌握利用校准曲线法进行定量检测的过程3. 掌握间接紫外法的基本原理，利用间接紫外法测定Cl-离子含量4. 了解毛细管表面改性与电渗流的关系二、教学内容-1. 电泳现象：带电粒子在外电场作用下向与其电性相反的电极发生定向移动的现象叫电泳。+（+）+-um（-）cm-（-）+-（+）-+- 普通尺寸的管道中只能观察到电泳 微管道中还能观察到电渗流离子电泳速率：正比于粒子的电荷-半径比（q/r），电场强度E，而与溶液粘度h成反比。电泳速度与淌度的关系：v=mE 物理化学中曾经有电泳实验。电泳分离：不同带电粒子泳动速度不同，从而得到分离。常规尺寸电泳的弊端：电泳速度慢、分离效率低、消耗样品量大、扩散严重。当把电泳通道逐渐减小至几十微米的毛细管，出现一种新的效应：电渗流电渗流：容器壁（这里为石英毛细管）在pH4，表面硅羟基Si-OH离解生成阴离子Si-O-。从而吸引溶液中正电荷形成双电层。正电荷在外电场作用下向阴极移动，由于体积小，管中溶液被带动一起向阴极移动，形成电渗流。2. 电渗流大小和方向：电渗流速度比电泳快5-7倍，因此正负离子和中性分子都向电渗流方向运动，并且产生速度差异，实现对各组分的分离。Vap= Vef + Veo =（mef+m eo）E=m apE3. 电渗流的流形与压力驱动流形：-+-（-）（+）+压力驱动压力驱动流形电渗流流形电渗流4. 电渗流方向的控制：如果测定阴离子，通过表面修饰CTAB（十六烷基溴化铵）进行改性，可使离子电泳方向与电渗流方向一致，从而加快出峰速度。与由于离子流方向变化，我们在分离时还要改变电压施加方向，变为左负右正。否则电渗流不经过检测器。5. 高效毛细管电泳常用的检测方法：紫外可见吸收法。检测器在靠近溶液出口一端。Cl-离子没有紫外吸收，用间接紫外法进行测定。原理：有色物质充满管道作为背景溶液，此时若无色离子取代一部分有色物质，则“稀释”了该背景吸收，产生一个倒峰。我们习惯了看正峰，仪器上有选项可以把倒峰转变为正峰显示出来。6. 实验里采用黄色的Na2CrO4为背景溶液。7. 由于毛细管尺寸小易堵塞、内壁性质受到杂质颗粒的干扰大，所以所有用水都是二次水，并且样品要用滤头过滤。8. 定量方法：校准曲线法。预设问题：1：假设电泳溶液为NaCl，在电泳过程中Na+向阴极移动，Cl-向阳极移动。一段时间后是不是说阴极附近只有Na+一种离子？而阳极周围由于Na+离去形成了阳离子的“真空”？2：使用毛细管进行电泳时，为什么要加高电压？高电压下进行实验两个电泳电极表面接触水的部分会不会爆炸？进行高电压分离的实验是不是很危险？3：显然，使用常规尺寸石英管在pH4时也可以形成双电层。为什么一定要在小的管径下才出现电渗流？小结形成电渗流的必要条件？4：根据电渗流产生的原因和条件，说说如何控制电渗流方向？我们实验里要检测Cl-，如果改变上图的电渗流方向，离子表观运动速度如何变化？实验里将用什么物质进行表面改性？三、实验步骤1）分别移取0.10、0.25、0.50、1.00、1.50mL 0.5M Cl- 储备液，用二次水定容至刻度，配得离子浓度为1.0、2.5、5.0、10、15mmol/L的Cl-标准溶液。所有溶液均用二次水。2）将5份标准溶液和CTAB缓冲液（实验员已配好，溶液中已含有CTAB、NaOH与NaCrO4）分别倒入相应标签的小烧杯中（之前用该溶液荡洗烧杯），用具有相应标签的针筒抽取3-4mL溶液。取孔径为0.22 um的滤头装在针筒头上。装紧，手掌握住针筒，拇指按压针筒，过滤溶液。前数滴过滤出的溶液滴入HPCE的样品小瓶，荡洗小瓶。之后将过滤后溶液滴入小瓶至溶液约充满小瓶2/3以上。（由于电泳电极和毛细管都会插入小瓶中，内充溶液过满可能导致溶液溢出。）盖上红色橡胶瓶盖。将小瓶放在CE专用的白色塑料盒中。3）CTAB缓冲共需过滤3瓶，其中两瓶作为电泳分离时电极和毛细管插入的溶液。为避免虹吸现象，应保持两瓶缓冲液面高度大致相同。领取3个空瓶盖好盖，一个作为废液瓶。另外两个备用。4）将盛放上述11个小瓶的塑料盒带回408。点击“load”，待样品托盘处于装样品位置后打开仪器盖。在仪器BI（bottle inlet）托盘上，将标准溶液从小浓度到大浓度依次放在C1、C2、C3、C4、C5位置上。C6放置待测Cl-。B6放置CTAB缓冲液，用于冲洗、平衡毛细管。BI D6，BO D1 (BO代表outlet方向的小瓶托盘)分别放置两瓶CTAB缓冲液，用于电泳分离样品。BI B1放置废液小瓶。在记录纸上记录所有位置的样品浓度，防止搞错。装样时注意转动小瓶，使小瓶上橡皮塞上的分隔为前后方向，不要沿左右方向。防止电极和毛细管叉在瓶盖上。（此要求不严格，实际上我们看到仪器自身震动就会改变瓶塞方向。也没有看到电极卡在瓶盖上的情况）5）新建方法：设定1. 冲洗：CTAB缓冲液冲洗；冲洗方式：压力，压力值：20psi，时间2min； （1 pound per square inch = 0.0680459639 标准大气压）入口BI B6，出口BO B1 2. 进样：选择某一样品位置处进样，进样方式：压力进样，0.5psi，5s 3. auto zero 自动基线调零 3. 电泳分离：时间设为0，电压8kV，时间5min，入口BI D6，出口BO D1，选择“反向”加压。 4. stop data（停止采样）：时间设为5.1.另外在pda检测器栏内选择“indirect”，把倒峰变为正峰。勾选channel1，选择波长为380nm。保存方法为：method1，路径为“F/wangkang/今天的日期（yy-mm-dd