ELISA 技巧.doc

抗原和抗体最佳工作浓度的确定抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。1）方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为08左右，阴性参考血清A值01的包被抗原稀释度为工作浓度。方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度 将抗体用包被液稀释为10mgL、lmgL、0.1mgL三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l 000、l:5000、l:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值0.1的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。抗体的稀释度稀释液及稀释度的测定方法 抗体的稀释度包括特异性抗体，中间抗体及标记抗体。任何一种免疫组化方法要想得到令人满意的染色效果，必须将抗体进行最佳稀释。一般来说，抗体的稀释度取决于下列因素。 (一)抗体的浓度(亦称滴度) 每毫升溶液内所含抗体分子越多，滴度就越高，该抗体可高度稀释，尤其是特异性一抗的稀释度。一般商品化抗体只知道每毫升含多少抗体蛋白量，不知道所含抗体分子。自己制备抗体可通过琼脂糖双扩散或放射免疫法进行测定。商品化抗体一般告知大约的稀释度，例如用PAP法可1：1001：200稀释。但往往购买到一种新抗体后，需要利用组织切片进行最佳稀释度的测定。 (二)稀释度的测定方法 在测定抗体最佳稀释度时，可将阳性强度与背景染色以“+”形式来表达，“+ + + +”为极强阳性，“+ + +”为强阳性，“+ +”为弱强阳性，“+”为弱阳性，“一”为阴性。 1直接测定法 按表24稀释抗体，4过夜，观察分析结果。从表24的结果中可知，400为最佳稀释度，因其特异性染色强，且背景低。 表2-4 抗体稀释度的直接测定法一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性 一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性l： 50 + + + + + + l：400 + + + (一) 1：100 + + + + + + 1：500 + + (一) 1：200 + + + + + 阴性对照 (一) (一) 1：300 + + + 2棋盘稀释测定法 按表25稀释、测定，从表中显示的结果可知，一抗1：100、二抗1：200为最佳稀释度。 表2-5 抗体稀释度的棋盘稀释测定法 第二抗体 一抗稀释度 1 ： 50 l：100 1：200 1：400 1：100 + + + +(+ +) + + + +(+ +) + + +(一) +(一) 1：200 + + + +(土) +(一) + +(一) +(一) 1：400 + +(一) +(一) (一) (一) 注：括号内为背景染色 (三)抗体的配制 抗体的配制及使用是开展免疫组织化学工作的一个重要环节，其检测的结果既要可靠，又要能重复，这就要求实验人员在配制抗体过程中要注意其精确度。目前，随着抗体稀释液的稳定性提高，一次稀释抗体可用一年。当然，还可以购买到商品化即用型一抗，使用非常方便。 (四)抗体稀释液的种类 可根据需要选择不同的抗体稀释液。如稀释当天用完的一抗，用005m01L(pH7.6)TBS即可。如需长期保存，可用如下稀释液：取01g明胶(或绿色明胶)溶在100ml0.05m01L(pH76)TBS缓冲液中，边搅拌边加热至60，待完全溶解后，冷却至室温，加入1g牛血清白蛋白，最后加入200mg aN3，分装保存在一40中备用。另外，抗体原液应分装后一40保存，可保存5年以上。二抗浓度确定： （丁香园）1. 目前看到有关ELISA棋盘法确定抗原抗体浓度,都是间接法和双抗体夹心法.我现在做的是直接法.实验过程是这样的:我先用提取到的蛋白(抗羊IgG)直接包被在板上,用BSA封闭,然后用羊IgG作一抗,最后用驴抗羊IgG-HRP作酶标.我买的酶标物说明ELISA的范围在1:2001:4000,我现在不知该如何确定羊IgG和驴抗羊IgG-HRP的最佳浓度.我做了一个实验,羊IgG的浓度分别为2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.125mg/ml,驴抗羊IgG-HRP为1:250,1:500,1:1000,1:2000,1:4000.用空白调零,得到的OD值显示出随羊IgG浓度下降而下降,也随驴抗羊IgG-HRP的稀释而下降.最高值达0.6,但我就是不知如何确定哪一组为最佳浓度.2.我也做了这方面的内容，我认为你没必要用棋盘法来确定因为直接法不用确定一抗的浓度，你直接将ng/ml的羊IgG进行包被，洗涤，用封闭，然后用你所说的驴抗羊IgG-HRP为1:250,1:500,1:1000,1:2000,1:4000分别加入，每个浓度加两个孔，每孔ul,最后显色，作曲线图，在图上找到值为对应的驴抗羊IgG-HRP的浓度即可抗原包被量一般是1-10微克每孔，从你的包被量上看，应该是足够的了，从你的OD值来看，有上升的趋势，但是OD值太小，我估计有三方面的原因：1.血清抗体效价太低2.二抗是否有问题3.包被的效果不好（可能是你的抗原不纯，含有其他的无关蛋白同抗原相竞争包被在酶标板上）至于最佳的浓度的标准是要以OD值接近为准的！￥抗原的包被浓度和抗体稀释都没有太大的问题，如果OD在0.02-0.09之间的话，应该说你的实验是失败的。同意楼上已总结了三个原因，你可依次排除：1、二抗的问题，可直接按说明书提供的稀释方法稀释二抗后包被酶标板，显色看看OD值高低，至少2.0以上（490nm）；2、抗体效价，可用标准血清做下对照，看看显色如何？3、抗原纯度应在使用前鉴定，另外包被与蛋白的等电点相关，一般包被液的pH应高于蛋白的等电点。最佳工作浓度的选择：在酶联免疫吸附试验中为防止本底高和灵敏度低，需要对包被抗体（抗原）和酶标抗体（抗原或二抗）进行滴定和选择最佳工作浓度。如夹心法最佳工作浓度的选择是用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。如下面衔接的表三所示，包被抗体选择3个浓，酶标抗体也选择3个浓度，分别与包被抗体的