连接蛋白43磷酸化.doc

3。Doble等14发现PKC可介导Cx43的Ser262位点的磷酸化,使GJ对染料的通透性下降,并参与调节细胞的DNA合成。TPA(PKC的激活剂之一)显著减少GJ通道的聚集,引起GJIC功能随时间逐渐降低;在PKC活性下调之后,GJIC又逐渐恢复正常6。在某些细胞中,TPA还可增加Cx43的降解11。在大鼠心肌细胞中,TPA激活PKC,降低单通道传导性和GJ对染料的通透性,却增加总的GJ传导性5。可能的解释是PKC降低通道的孔径和单通道传导性的同时,使通道开放概率和(或)通道数量增加11。也有报道发现,同样在新生大鼠心肌细胞,PKC的激活并不明显影响GJ的传导性6。PKC除了可以直接磷酸化Cx43的Ser368和Ser372位点外,还可能通过激活其他激酶,如MAPK等,间接地磷酸化Cx43的其他位点,影响GJIC11。因此,PKCs对Cx43磷酸化状态和GJ功能的确切作用及其机制可能与GJ通道的聚集/解聚、单通道传导性的改变和Cx43的降解等关系较为密切12。3.1.3丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)MAPKs包括ERK1/2、BMK-1(ERK5)、p38、JNK等。MAPK可磷酸化Cx43的Ser279和Ser282等位点,引起GJIC快速短暂性降低5。茴香霉素(anisomycin)通过p38MAPK途径磷酸化Cx43,加快其降解,使WB-F344细胞间的GJ通透性(染料转移)降低15。MAPK可以增加Cx43的磷酸化程度,使心肌细胞间电传导性增强;而在非心肌细胞,则使GJ对染料的通透性降低,可能是由于通道孔径减小的程度使较小的离子仍可以通过,而较大的分子则不能5,15。3.1.4酪蛋白激酶1(CK1)CK1可能对Cx43的GJ装配起调节作用,特别是在基础状态下4。研究提示,可能是CK1delta亚型直接磷酸化Cx43的Ser325、328或Ser330等位点,调节细胞膜上的Cx43装配形成GJ通道,使GJ传导性增加4,5,16。3.1.5细胞周期依赖性激酶Cdc-2有丝分裂时细胞内的Cdc-2激酶可磷酸化Cx43的Ser255,或通过激活其他激酶使Cx43磷酸化,使GJ通道转移至细胞内,引起GJIC短暂的降低7,17。3.1.6蛋白激酶G(PKG)在大鼠心肌细胞中,cGMP可激活PKG,可能通过磷酸化Cx43的Ser257,降低单通道传导性,使细胞间传导性和对染料的通透性降低;而对人类Cx43形成的GJ通道功能不起作用,可能是由于人类Cx43在该位点上为丙氨酸Ala5,16。3.2蛋白酪氨酸激酶(PTK)3.2.1受体酪氨酸蛋白激酶EGF和PDGF可激活相应受体的酪氨酸蛋白激酶活性,可能通过MAPKs间接引起磷酸化Cx43的增加和GJIC快速而短暂的破坏,因为Cx43的磷酸化是在Ser残基,而不是Tyr残基5,6。3.2.2非受体酪氨酸蛋白激酶v-Src直接磷酸化Cx43的Tyr247和Tyr265位点,降低细胞间通道的传导性和通透性(染料转移),可能与降低通道开放概率有关,而非通过降低单通道传导性6。v-Src的SH3结构域与Cx43富含脯氨酸的P274-P284区域结合,v-Src先磷酸化Cx43的Tyr265位点;v-Src的SH2与磷酸化Tyr265进一步结合,并再次磷酸化Cx43的Tyr247位点,最终可能通过所谓的“颗粒-受体(particle-recep-tor)”机制使通道关闭5。另有研究提示,化学性缺血缺氧使Cx43丝氨酸残基去磷酸化的同时,通过c-Src磷酸化Cx43的酪氨酸残基8。该研究对阐明脑缺血、心肌缺血时GJ功能紊乱的机制具有重要意义。此外,在某些情况下,激活的Src可以刺激丝氨酸激酶的活性,间接地增加Cx43丝氨酸残基的磷酸化程度13。3.3蛋白磷酸酶磷酸化丝/苏氨酸蛋白磷酸酶:PP1和未知的蛋白质磷酸激酶参与基础状态下Cx43的磷酸化状态的紧张调节(tonic modulation);当磷酸化途径被阻断时,PP1使Cx43去磷酸化,降低GJ功能1。磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶:过钒酸盐(per-vanadate)抑制磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶,引起Cx43的酪氨酸残基磷酸化和GJ通道的关闭18。受体酪氨酸蛋白酶可能使Cx43保持酪氨酸非磷酸化状态,防止通道关闭16。碱性磷酸酶:通过膜片钳将碱性磷酸酶注入新生大鼠心肌细胞内,可显著增强单通道传导性,而却使总体的GJ通道传导性降低1。272国际心血管病杂志2007年7月第34卷第4期Int J Cardiovasc Dis,July2007,Vol.34,No4接形成GJ通道。GJ分布广泛,功能多样。GJ介导的细胞间电耦联和化学耦联是心脏正常电-机械活动的重要保障之一。连接蛋白43(connexin43, Cx43)由382个氨基酸组成。Cx43的C-末端是多种磷酸化作用和蛋白质结合的位置,对GJ通道功能的调节起关键作用。Cx43首先在内质网合成,然后转运至高尔基复合体,最后在细胞膜上聚集(assembly)形成缝隙连接3。Cx43的半衰期比其他膜蛋白短,约15h左右4。较短的半衰期对快速调节通道数量具有重要意义。2缝隙连接通道功能的调节GJ通道的功能包括介导细胞间电耦联和化学耦联。除了细胞间物质的浓度差之外,GJ通道介导的物质转移还取决于单通道传导性、通道开放概率和通道数量。单通道传导性以及细胞-细胞间传导性和通透性受多种因素的调节,如胞内pH值、Ca2+浓度、ATP浓度和Cx43的磷酸化状态以及与Cx43结合的辅助蛋白等;而通道的数量与Cx43的合成、转运及其降解状况有关5。各种调节因素由于对通道开放概率和通道孔径大小的影响不同,也可对细胞-细胞间电耦联与化学耦联(对染料的通透性)造成不同甚至相反的效应5。此外,不同种属和不同细胞的差异、各种调节机制的相互作用以及作用时的环境条件,都可影响缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的最终效应。3缝隙连接功能与磷酸化/去磷酸化多种激酶和蛋白磷酸酶可通过不同环节,包括影响Cx43的合成、转运、聚集/解聚、更新和降解以及通道门控等,来调节GJ的功能。Cx43的C-末端含有多个Ser/Tre和Tyr残基,这些酶可作用于上述位点,改变Cx43的磷酸化状态,进而影响GJ的功能。在转运至细胞膜之前,Cx43部分氨基酸残基可被磷酸化,主要是丝氨酸残基;而有些磷酸化则可以发生在Cx43到达细胞膜之后6,7。由于磷酸化程度不同,Cx43在SDS-PAGE电泳凝胶上可形成多条区带,P0(非磷酸化)、P1(部分磷酸化)和P2(高度磷酸化)等区带4-6。有丝分裂期的细胞甚至可以在P2之后出现P3条带7。基础状态下的心肌细胞内,某些未知的蛋白激酶与磷酸酶(PP1)之间的平衡可能对GJ细胞间通讯产生紧张调节(tonic modulation)作用,使Cx43保持磷酸化状态,维持正常的GJ功能1。心肌缺血和其他多种因素可使Cx43去磷酸化,导致GJ功能和分布紊乱,参与心肌坏死和心律失常的发生。研究显示,Cx43酪氨酸残基的磷酸化状态对其在凝胶电泳移动性的改变的决定作用不大,主要可能与丝/苏氨酸残基的磷酸化状态的改变有关8。利用Cx43在电泳凝胶上移动性的改变,是判断其磷酸化较为简单和常用的方法,但特异性和敏感性值得商榷。特异性抗Cx43磷酸化位点抗体的出现,为今后的研究提供了有力的帮助。3.1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3.1.1蛋白激酶A(PKA)cAMP/PKA对GJIC功能和Cx43磷酸化状态(直接或间接)的影响,尚存在争议。磷酸化的Ser364可能对cAMP引起的GJ装配增加起关键作用,而对基础状态下的GJ装配的作用较为次要4,9。Yogo等10发现FSH可引起大鼠颗粒细胞Cx43的Ser365、368、369、373等位点的超磷酸化,并提示这些位点的磷酸化可能与cAMP/PKA有关,而去磷酸化则可能使GJ通道的通透性(染料转移能力)降低。cAMP/PKA对GJIC的不同作用以及可能的机制是11:(1)缓慢增强,主要是由于基因表达和(或)蛋白合成增加;(2)快速减弱缝隙连接通道的通透性,机制未明;(3)快速增强,增加通道开放概率、增加单通道传导性、促进Cx43连接小体装配形成功能性通道以及增加Cx43从高尔基体运输至胞膜9,11。这与不同的细胞类型、不同的PKA亚型以及该酶胞内位置的差异等有关。3.1.2蛋白激酶C(PKC)PKCs对Cx43和GJ的作用也同样存在争议。许多PKC的激活剂可以增加多种细胞的Cx43磷酸化程度,降低GJ功能。Lampe等12研究表明,PKC在体内可直接磷酸化Cx43的Ser368位点,使非心肌细胞GJ的单通道传导性和对染料的通透性降低。油酸通过PKC的epsilon亚型和Src激酶,介导大鼠心肌细胞Cx43的Ser368磷酸化,增加GJ的解聚(dis-271国际心血管病杂志2007年7月第34卷第4期Int J Cardiovasc Dis,July2007,Vol.34,No4连接蛋白43磷酸化状态与心脏缝隙连接通道功能的关系王云胜综述林吉进谭学瑞审校【摘要】缝隙连接是介导相邻细胞间直接通讯的特殊膜结构。心室肌细胞间的缝隙连接通道主要由连接蛋白43(Cx43)构成。Cx43的磷酸化状态除了快速调节通道的开放/闭合状态(单通道传导性和通道开放概率),还可通过影响Cx43的合成、转运、聚集/解聚和降解等不同环节,改变活化通道数量,最终实现对缝隙连接功能的调控。迄今,已发现多种激酶和蛋白磷酸酶可直接和(或)间接调控Cx43羧基末端的丝氨酸残基和酪氨酸残基的磷酸化状态,从而影响缝隙连接通道的功能。磷酸化/去磷酸化影响Cx43和缝隙连接通道功能的确切作用和具体机制未明。本文就Cx43磷酸化状态与心脏缝隙连接通道功能的关系作一综述。【关键词】缝隙连接;连接蛋白43;磷酸化;去磷酸化;心脏中图分类号:R541.7文献标识码:A文章编号:1673-6583(2007)04-0270-04资助项目:国家自然科学基金项目(30470731);广东省自然科学基金(021227)作者单位:515041汕头大学医学院第一附属医院心内科1缝隙连接与连接蛋白43缝隙连接(gap junction,GJ)通道是介导相邻细胞间直接通讯的特殊膜结构,由连接蛋白(con-nexins, Cxs)构成。现已发现人类连接蛋白基因家族有21个成员,其编码的连接蛋白相对分子质量从25 000到62 000不等1,2。6个连接蛋白形成一个连接子(connexon,亦称为半通道,hemichannel),相邻细胞接触面上的连接子(半通4结语到目前为止,已发现Cx43的CT末端上21个Ser残基中的13个和6个Tyr残基中的2个可以被磷酸化。Ser残基的磷酸化状态对GJ通道功能的影响较为复杂,而Tyr残基磷酸化状态对GJ通道功能的影响似乎较为肯定,即使GJ通道功能降低。不同激酶可作用于相同位点,而相同的激酶又可作用于不同位点。各种激酶和磷酸酶,除了直接作用于Cx43,还可以通过作用