DB21∕T 1977-2012 水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法.doc

ICS65.020.60B21DB21辽宁省地方标准DB 21/ XXXXX2012水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法Protocol of the polymerase chain reaction for detectinggenetically modified components of Bt gene in riceXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/ XXXXX2012目次前言II1范围12规范性引用文件13术语、定义和缩略语14原理15试剂16仪器27抽样与制样38操作步骤39结果分析与表述5前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省质量技术监督局提出并归口。本标准由沈阳农业大学、辽宁省标准化研究院负责起草。本标准主要起草人：崔震海、杨立宏、张立军、邱学思、徐正进、李丹莉、樊金娟、阮燕晔、姜宏、朱延姝、汪澈、曹松屹、秦萍。5水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法1 范围本标准规定了水稻中转Bt基因成分的PCR定性检测的原理、试剂、仪器、抽样与制作、操作步骤、结果分析和检测结论。本标准适用于转基因水稻及其衍生品种，以及制品中的转Bt基因成分的定性PCR检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 1194 植物及其产品转基因成分检测抽样的制样方法SN/T 1943 小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法SN/T 2102.1 食源性病原体PCR检测技术规范 第1部分：通用要求和定义3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义SN/T 1943的术语和定义适用于本标准。3.2 缩略语3.2.1PCR: polymerase chain reaction，聚合酶链式反应，简称PCR。3.2.2RBE4 gene：rice starch branching enzyme 4，淀粉分支酶基因。3.2.3CaMV 35S：35s promoter from cauliflower mosaic virus，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。3.2.4NOS：terminator of nopaline synthase gene，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒胭脂碱合酶（nopaline synthase）基因的终止子。3.2.5Bt gene：Bacillus thuringiensis gene，苏云金芽胞杆菌基因，简称Bt基因。包括cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ab/cry1Ac融合基因4 原理水稻样品经过DNA提取后，针对转Bt基因水稻中外源的CaMV 35S启动子、NOS终止子、Bt基因，以及内源的RBE4基因，设计特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特异性DNA片段，判断水稻及其制品中是否含有转Bt基因成分。5 试剂除非另有说明，本方法试剂均为分析纯试剂和重蒸馏水。5.1 琼脂糖5.2 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）溶液5.3 1 mol/L Tris-HCl溶液(1000 mL)称取121.1 g Tris溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至7.5，加水定容至1000 mL。5.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液(200 mL)在160 mL水中加入80 g氢氧化钠，溶解后加水定容至200 mL。5.5 0.5 mol/L EDTA溶液(100 mL)称取Na2EDTA2H2O 18.6 g，加入70 mL 水中，再加入氢氧化钠溶液适量，加热溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，用水定容至100 mL。5.6 CTAB提取缓冲液(1000 mL)在600 mL 水中加入81.7 g 氯化钠，20 g CTAB，充分溶解后加入1 mol/L Tris-HCl溶液100 mL，0.5 mol/L EDTA溶液40 mL，用浓盐酸或氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至1000 mL，分装后高压灭菌。5.7 CTAB沉淀缓冲液(1000 mL)在800 mL 水中加入2.3 g 氯化钠，5 g CTAB，充分溶解后加水定容至1000 mL，分装后高压灭菌。5.8 1.2mol/L氯化钠溶液(100 mL)在60 mL 水中加入7.01 g 氯化钠，溶解后加水定容至100 mL，高压灭菌。5.9 70%乙醇溶液(1000mL)取700 mL 无水乙醇，加水定容至1000 mL。5.10 TE缓冲液(1000 mL)在800 mL 水中依次加入1 mol/L Tris-HCl溶液10 mL，0.5mol/L EDTA溶液2 mL，用浓盐酸或氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至1000 mL，分装后高温高压灭菌。5.11 Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1（体积比）5.12 0.5TBE缓冲液先在800 mL 水中加入10.18 g Tris，5.51 g 硼酸，0.75 g Na2EDTA2H2O，溶解后加水定容至1000 mL，即为5TBE缓冲液，作为母液备用。使用时用水稀释10倍，即为0.5TBE缓冲液。6 仪器6.1 常规实验室设备应符合SN/T 2102.1的规定。6.2 PCR扩增仪。6.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4 紫外透射仪。6.5 凝胶成像系统或照相系统。6.6 紫外分光光度计。7 抽样与制样按照SN/T 1194规定的方法执行。8 操作步骤8.1 DNA提取操作步骤8.1.1 CTAB法将200 mg300 mg待测样品，在液氮中充分研磨成粉末后加入1.5 mL 预热至65 的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，不同试样可适当增减缓冲液的用量，65 水浴保温30 min，其间不停颠倒混匀，12 000 r离心10 min，将上清转移至离心管中。加入1倍体积的Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混合，12 000 r离心15 min。将上清转移至新离心管中，加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置60 min，12 000 r离心15 min，弃上清。加入350 L氯化钠溶液溶解沉淀，12 000 r离心10 min。将上清转移至新离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20 min。12 000 r离心15 min ，弃上清。加入500 L 70乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12 000 r离心10 min，弃上清。将DNA沉淀自然风干，加100 L 水或TE缓冲液溶解DNA。8.1.2 试剂盒法 水稻总DNA的提取也可使用相应DNA提取试剂盒。8.2 DNA浓度测定取DNA提取溶液，测定其在260 nm 和280 nm 的紫外光吸收率，OD260值为1相当于50 g/mL 的双链DNA。DNA溶液OD260/OD280的比值在1.72.0之间为宜，此时DNA质量符合PCR扩增检测的要求。用0.8% （w/v）的琼脂糖凝胶电泳观察总DNA是否降解。8.3 PCR反应8.3.1 引物8.3.1.1 引物相关基因8.3.1.1.1 RBE4基因淀粉分支酶（rice starch branching enzyme 4）基因，是水稻内源基因。8.3.1.1.2 CaMV 35S启动子花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus）35S的启动子。8.3.1.1.3 NOS终止子根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒胭脂碱合酶（nopaline synthase）基因的终止子。8.3.1.1.4 Bt基因 Bt gene指cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ab/cry1Ac融合基因。8.3.1.2 引物序列检测基因引物序列 (5-3)PCR产物大小(bp)RBE4RBE4-F1: TTGCGCCTGAACGGATAT277RBE4-R1: GGAGAAGCACTGGACGAGGCaMV 35S35s-F1: GCTCCTACAAATGCCATCA19535s-R1: GATAGTGGGATTGTGCGTCANOSNOS-F1: ATCGTTCAAACATTTGGCA165NOS-R1:ATTGCGGGACTCTAATCATABtBt-F1: GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC301Bt-R1: CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT8.3.2 PCR反应体系试剂终浓度体积10PCR 缓冲液12.5 L25 mmol/L MgCl22.5 mmol/L2.5 LdNTPs0.2 mmol/L2.0 L10 mol/L 上游引物0.5 mol/L0.5 L10 mol/L 下游引物0.5 mol/L0.5 L5 U/L Taq 酶0.025 U/L0.125 L25 ng/L DNA 模板1 ng/L1.0 L用ddH2O补足反应体系至25 L注：PCR缓冲液中如含有Mg2+，就不在反应体系中加MgCl2。8.3.3 PCR反应程序95 变性5 min；进行35次循环扩增反应（94 变性1 min，56 退火30 s，72 延伸30 s）；72 延伸7 min。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4 下保存待用。8.4 对照PCR反应PCR反应进行的同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照以非转基因水稻材料中提取的DNA作为模板进行PCR反应；阳性对照以转Bt基因抗虫水稻DNA或阳性质粒DNA作为模板进行PCR反应；空白对照两个，分别以无菌蒸馏水和不加试样的DNA空白提取液作为模板进行PCR反应。8.5 PCR产物电泳检测称取0.8 g 琼脂糖粉末，加入40 mL 0.5TBE缓冲液中，加热至琼脂糖完全溶解配制成浓度为2.0%（w/v）的琼脂糖溶液，然后加入2L EB溶液，混合均匀。趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20 min 以上，待完全凝固后垂直拔去梳板。吸取3-5 L与上样缓冲液混匀的PCR产物，加入琼脂糖凝胶的点样孔，并用适当的DNA Marker作为分子量标记，进行电泳检测。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶用凝胶成像系统观察是否出现特异性DNA电泳条带，将电泳结果用照相系统拍照。9 结果分析9.1 内源基因的检测通过对阴性对照、阳性对照和待测样品RBE4基因片段进行扩增，均获得预期大小一致的片段，可以进行外源基因的检测，否则需重新提取DNA。9.2 外源基因检测首先筛选检测CaMV 35S启动子和/或NOS终止子基因，检测结果为阳性，进一