植物组织培养复习习题.doc

绪论课后讨论题：1、对植物组织培养技术的展望。2、植物组织培养发展史的各个时期，有哪些主要的培养技术获得成功？课外作业题：1、什么叫植物组织培养技术？它有哪些类型？其理论依据是什么？植物组织培养的概念可以分为广义和狭义。广义的植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌和人工预知的控制条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织或细胞进行离体培养，使其再生细胞或生长、分化成完整植株的技术。狭义的植物组织培养仅指对植物的组织（如分生组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养产生的愈伤组织（callus）进行离体培养的技术。从培养对象上来看，植物组织培养主要有植株的培养、组织培养、器官培养、胚胎培养、细胞培养及原生质体培养，目前，由这六方面的研究类型又延伸出多种应用领域的研究工作。植物组织培养的主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。2、从外植体到小植株有哪些培养途径？离体器官的分化有三种比较典型的分化途径：一是由分生组织直接分生芽；二是由分生组织形成愈伤组织，经过分化实现细胞的全能性；三是游离细胞或原生质体形成胚状体(embryoid)，由胚状体直接重建完整植株，或制成人工种子后再重建植株。愈伤组织再分化时，可经过两条途径，一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株，因为芽和根都是植物体的器官，所以这一过程叫器官发生途径。二是在愈伤组织中产生出一些与种子中的胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。3、试述目前植物组织培养的应用。 植物组织培养研究领域的形成，不仅丰富了生物学科的基础理论，还在实际应用中表现出巨大的价值，显示了植物组织培养的无穷魅力。目前，该领域的研究成果主要应用于植物离体快繁、无病毒苗木培育、培育新品种或创制新物种、次生代谢物生产、种质资源保存及人工种子。（1）植物离体快繁（无性系快速繁殖）植物离体快繁是植物组织培养在生产上应用最广泛、产生较大经济效益的一项技术。离体快繁的特点是繁殖系数大、周年生产、繁殖速度快、苗木整齐一致，快速繁殖的植株能保持母本的生物特性和遗传性状，并可在短期内种植于田间等。（2）无病毒苗木培育 很多农作物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等，病毒在体内积累，影响其生长和产量，对生产造成极大损失。因此，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生植株就可脱除病毒，获得脱病毒小苗。用脱毒小苗种植的作物就不会或极少发生病毒，并且植株生长势明显增强，整齐一致，产量增加，（3） 培育新品种或创制新物种 应用植物组织培养的理论和技术，可以加速育种进程，培育新品种或创制自然界中的新物种。A 培育远缘杂种 受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。通过原生质体的融合，可以克服有性杂交不亲和性，从而获得体细胞杂种，创制出新物种或新类型，这是组织培养应用很诱人的一个方面。B离体选择突变体 培养的细胞无论是愈伤组织还是悬浮细胞，由于处在分裂状态，易受培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响产生变异，从中可以筛选出对人类有用的突变体，从而育成新品种。C 单倍体育种 离体花药花粉培养的单倍体育种法，与常规方法相比，基因型可快速纯合，可以在短时间内得到作物的纯系，从而加快育种过程，因而单倍体育种已成为一种新的育种手段。（4） 次生代谢物生产利用组织或细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。（5） 植物种质资源的离体保存种质资源(germplasm)是农业生产的基础，而自然灾害、生物间竞争及人类活动等已造成相当数量的植物物种消失或正在消失，特别是具有独特遗传性状的生物物种的绝迹更是一种不可挽回的损失。现在已有许多种植物在离体条件下，通过抑制生长或超低温贮存的方法，使培养材料能长期保存，并保持其生活力，既节约了人力、物力和土地，还防止了有害病虫的人为传播，更便于种质资源的交换和转移，给保存和抢救有用基因带来了希望。6 人工种子第1章 植物组织培养实验室的基本设备和一般技术课堂讨论题：1、为了降低生产成本，组培室的设计应注意哪些问题？2、在高温高压灭菌过程中应该注意的哪些问题？课外作业题1、简述培养基和器具的灭菌方法和技术。植物组织培养的培养基由于含有高浓度蔗糖，能供养很多微生物如细菌和真菌的生长。一旦接触培养基，这些微生物的生长速度一般都比培养的组织快得多，最终将把组织全部杀死。这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物。因此，在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。为达到这个目的，有两点必须注意：不要与微生物工作者或病理工作者共用组织培养工作区；一经发现，立即将污染的培养物拿出培养室进行处理。（1）培养基的灭菌 A高压蒸汽灭茵法 由于未经灭菌处理的培养基既可能带有各种杂菌，同时又是各种杂菌良好的生长繁殖场所，因此培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。高压蒸气灭菌有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种，在使用高压灭菌锅时，应注意以下几点：使用高压锅前应添加足够的水；锅内气压太高(超过1.52105Pa)会引起部分有机物质的分解；灭菌后在气压表归零之前不要打开锅盖，以免发生危险和培养基外溅现象；橡胶等有机物品会因高温高压而变性；高压灭菌锅内有一个自动排气的小孔，不要使其堵塞，否则会因气压升高而引起危险。B过滤除菌法当培养基中含有吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等遇热不稳定的生物活性物质，不能进行高压蒸气灭菌，而必须采用过滤方法灭菌。过滤灭菌的原理是溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。通常采用减压过滤装置和过滤灭菌器，前者主要由过滤器和抽气系统两部分构成，后者需在超净工作台上进行，适合少量溶液过滤。首先将灭菌过程中需使用的所有器皿用干热灭菌法或高压灭菌法灭菌，然后再进行培养基的除菌操作。除菌后的培养基需要在超净工作台内分装。与高压灭菌方法相比，过滤除菌法操作麻烦，有时效果不如高压灭菌法，但是可以确保有机添加物不被破坏。也可采用部分除菌法，即先将高温下易破坏的有机成分配成水溶液，进行过滤除菌后放在超净工作台内。培养基中的其他成分按正常方法配制并进行高压灭菌，再将二者在超净工作台上配合、定容后分装。（2） 器具的灭菌A干热灭菌法干热灭菌法是将器具长时间放在高温下消除杂菌的一种方法。其具体做法是将需要灭菌的器具(玻璃器皿或器械)先用铝箔包好，放入温度设定为150的恒温干燥箱内，保温2h，取出冷却后便可以使用。B高压蒸汽灭茵法高压蒸汽灭菌法是将需灭菌的玻璃器皿、器械或培养基等放在高压蒸汽灭菌锅内，通过高温高压进行灭菌的一种方法。一般在1.06 kgcm2的压力下(121 )下保持1520min，就可达到灭菌效果。对于无菌操作所用的各种器械，如镊子、解剖刀、解剖针等，可采用灼烧灭菌。一般的消毒办法是把它们先在95酒精中浸一下，然后再置火焰上灼烧，然后放在灭过菌的支架上，待冷却后使用。这些器械不但在每次操作开始前要这样消毒，在操作期间也还要再消毒几次。2、简述植物材料消毒的一般过程。 第一步：材料的修整、刷洗、冲洗。采回来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细弄干净，如用适当的刷子、画笔等刷洗，硬的材料可用刀刮。把材料切割到适当大小，视清洁程度而异，置自来水龙头下，流水冲洗几分钟至数小时。第二步：是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动。洗衣粉可按每100m1水加12角匙的量配制，即浓度较高为好。这是进一步减少污染的处理。大约浸搅5分钟，然后再用自来水冲净洗衣粉水。用洗衣粉浸洗过的材料，可以除去轻度附着在上面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌溶液的直接接触。第三步：材料的表面灭菌。此过程要在超净台或接种箱内操作。将一干净烧杯(大小视材料多少而定)或广口瓶内、外表面用70酒精棉球擦拭作表面灭菌，放一经同样处理的玻璃棒，置于超净台(已开机10分钟以上)或已灭好菌的接种箱内，再把处理好的植物材料置入，同时已准备好了消毒溶液、无菌水、待用培养基等。在持续消毒的时间内不时用玻璃棒轻轻搅动或盖上广口瓶盖轻轻摇动，以促进植物材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到预定时间之前12分钟，即开始把消毒溶液倒入另一准备好的大烧杯中，要注意勿使材料倒出。倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。3、常用灭菌剂有哪些？其消毒原理是什么？各有哪些优缺点？ 灭菌剂使用浓度()持续时间(分钟)去除的难易效果次氯酸钙次氯酸钠过氧化氢(双氧水)溴水硝酸银氯化汞(升汞)抗生素510210121210.11450ppm5305305152105302153060易易最易易较难较难中很好很好好很好好最好比较好多数人提倡在倒入正式的灭菌剂之前，用70酒精作短暂灭菌，一般在1030秒左右，酒精除杀菌作用外，也有使材料表面易被浸湿的作用。要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂，确定适宜的处理时间和水洗的次数。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌，故灭菌时用广口瓶加盖或带螺旋盖的其它广口器皿较好。过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌，这3种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗34次就可以了。而用升汞溶液灭菌的材料，因升汞的残毒较难去除，应当用无菌水涮洗81 O次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。我们在工作中都是采用升汞，当增加无菌水涮洗的次数之后效果很好。灭菌溶液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器里灭菌很多材料。否则，污染会大幅度增加。如果外植体表面污染很严重，可先通过种子培养得到无菌种苗，然后再用其各个部分，如根段、茎段和叶片等建立组织培养。4、简述植物组织培养无菌操作技术的一般过程。（1） 无菌操作室消毒无菌操作室除定期熏蒸灭菌外，还要经常通过紫外灯灭菌。（2）无菌操作步骤目前多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。具体的无菌操作步骤如下：A. 在实验之前30min将超净工作台的紫外灯打开，进行灭菌。工作人员要避免紫外线照射。做实验时将紫外灯关闭。B. 用酒精喷壶或酒精棉将超净工作台消毒（酒精浓度为70）。C. 实验操作前，工作人员的手和小臂用70酒精消毒。D. 使用的镊子、解剖刀等用90酒精浸泡，之后放在酒精灯上火烧灭菌，再放在灭菌支架上冷却后使用。E. 在植入或移植材料的前后，培养瓶的瓶口须在酒精灯火焰上烧烤灭菌。第二章 培养基课堂讨论选题：植物生长发育的必需元素有几种？必需元素的条件是什么？其在植物体内的生理作用主要有哪几方面？课外作业题：1、常用培养基分为哪几类？各类的主要特点是什么？MS培养基是1962年Murashige和Skoog为培养烟草材料而设计的。特点是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也比较适合，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用最广泛的一种培养基。但它不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求较低的植物，尤其不适合过高易发生毒害的植物。与MS培养基较为接近的还有LS培养基(Linsmaier和Skoog，1965)及ER培养基(Eriksson，1965)。与MS培养基相比，于1943年设计，1963年作了改良的White培养基则是一个无机盐浓度较低的培养基。它的使用也很广泛，同时它还非常适合于生根培养和胚胎培养。B5培养基是1968年由Gamborg等设计的。它的主要特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物（如豆科植物）特别是木本植物，却更适合生长。N6培养基是1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的，其KN03和(NH4)2S04含量高且不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。此外，SH(Schenk和Hidebrandt，1972)培养基与B5相似，不用(NH4)2S04而改用NH4H2P04，在不少单子叶和双子叶植物上使用，效果很好。马铃薯简化培养基是为适应经济条件较差的农村农科站和中学而设计的，既经济又适用，容易取材，有利于组培技术推广和普及。2、培养基的成分有哪些？各有什么作用？目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由水、无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。1 水分 水分是一切生物生命活动的物质基础。细胞内的生化反应都是以水为介质进行的，而水分又是很多生物化学反应的原料或代谢产物。总之，生物的生命活动离不开水分。构成培养基的绝大部分组分为水分。2 无机营养物(无机盐)无机营养物包括大量元素和微量元素。植物所需元素的浓度大于0.5mmol/L的称大量元素，包括碳 (C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、和镁(Mg)。它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。植物所需元素的浓度小于0.5mmol/L的称微量元素，其需要量很少，一般大多为10-510-7 mmolL-1，多了会生毒害。培养基中的微量元素主要包括铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(C1)、硼(B)和钼(Mo)等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。3 碳源和能源植物组织培养中被培养的外植体，有的没有绿色，不能进行光合作用，有绿色的也难以通过光合作用获得足够的碳素，为促使培养物快速生长，一般都要人工提供碳源作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖最常用，效果也最好。糖类在培养基中除了作为碳源和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用。一般来说，蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3132，即约有1425的蔗糖用于保持培养基的渗透压。4 维生素类 维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素类的种类很多，在植物组织培养中通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.11.0 mgL-1，在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的，而烟酸及Vit.B6对生长只有促进作用。肌醇(环己六醇)本身不促进外植体生长，但可能有助于活性物质发挥作用，提高Vit.B1的效果，从而促进外植体生长、胚状体及芽的形成；培养基中的肌醇用量为50100mgL-1。5 氨基酸及有机附加物在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)等，它们是培养基中重要的有机氮源。另外，在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白(LH)、水解酪蛋白(CH)、天然的有机物如椰子汁(椰乳，10或100150 mlL-1)、玉米胚乳、酵母浸出物（O.5）等。其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等，可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用。6 植物生长调节物质生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素类最为常用。（1） 生长素类它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。（2）细胞分裂素类它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。由于这类化合物有助于使腋芽由顶端优势的抑制下解放出来，因此也可用于枝条的增殖。7琼脂它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢，所以在植物组织培养中一直被作为首选固体培养基质而广泛应用。8 其他成分（1） 活性炭活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响。另 外 ，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。此外，活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。（2） 硝酸银离体培养中的植物组织会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至会导致培养物的衰老和落叶。AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。因此，在培养基中加入适量的AgN03，无论是在单子叶植物，如小麦和玉米中，还是在双子叶植物，都能起到促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生的作用，并能使某些原来再生困难的物种分化出再生植株。3 抗生素加入抗生素的主要目的是是防止由外植体内生菌造成的污染，减少培养物中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素可节约人力、物力和时间。4 防止酚类物质污染的添加剂植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后自动氧化或由酶类氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以至黑色，这些物质渗出细胞外会造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡，这就是酚污染。抗酚类氧化常用的药剂有半光氨酸及盐酸盐，可用mg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其它的抗氧化剂有抗坏血酸、谷光甘肽等。3、试述培养基选择的方法。培养基的选择是植物组织培养中较为关键的环节。选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。可根据实验目的和实验材料确定一种合适的基本培养基。组织培养中对培养物影响最大的是外源激素，在基本培养基确定之后，实验中要大量进行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的配合试验。可用“广谱实验法”确定各种激素的有无及浓度。4、简述培养基配制的基本过程。一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。另一个是先配制一系列的浓缩贮备液(母液)，包括大量元素、微量元素、铁盐、除蔗糖之外的各种有机物质，浓度为培养基配方使用浓度的10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍，甚至1000倍。平时应贮存在24冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。培养基母液的配制母液的配制有两种方法：一种是配制成单一化合物母液；另一种是配成几种不同化合物的混合母液。前一种方法适合配制多种培养基都需要的同一种母液；后一种方法在大量配制同种培养基时省时省力。配好的母液应放在试剂瓶中贮存。药品及用具的准备：培养基母液的准备用具、用品的准备培养基配制：称取所需量的琼脂，蔗糖等，加热溶解 按比例加入所需各类母液调节培养基的酸碱性培养基的分装培养基的灭菌第三章 细胞的全能性与器官发生1、 简述植物细胞全能性、细胞分化、脱分化与再分化的概念。植物细胞全能性（totipotency）是植物组织培养的理论基础。它是指一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。细胞分化(differentiation)是指生物在个体发育过程中细胞由一般变为特殊的现象，即普通形态结构的细胞，向着不同形态结构的方向发展，从而在机能上也各不相同。由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞即愈伤组织的现象（或过程）称为“脱分化”(dedifferentiation)。由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，进而构成一个完整的植物体或植物器官的现象（或过程），叫做“再分化”(redifferentiation)。2、再分化有哪几种方式？它们的特点是什么？（1） 细胞水平的再分化再分化中首先可见的是细胞壁变厚、假导管细胞的形成及酶水平的变化和明显的机能分化，从而形成各种类型的细胞。（2） 组织水平的再分化当愈伤组织在高水平生长素条件下，最常见的是维管组织的分化。松散的愈伤组织内含有大量拟分生组织或瘤状结构。致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。(3) 器官水平的再分化器官水平的再分化又称为器官发生。再分化的组织可形成各种器官，如根、茎或芽、叶、花以及多种变态的器官(如鳞茎、球茎、块茎等)。根据起源不同，器官发生可分为器官型和器官发生型。前者直接由外植体的细胞形成器官原基，继而发育成器官；后者由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基。在有些情况下，器官是由切下的外植体中已存在的器官原基发育而成的，但大多数是经分化重新形成的。(4) 植株再生根和茎(包括其变态器官)或芽器官的发生可使植株重建。在离体培养中通过根、芽发生而形成再生植株的方式大致有三种：芽产生后，芽的基部长根形成小植株；先形成根，根上再出芽；愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后形成维管组织把两者结合起来形成一个植株。一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或植物器官的能力，即不同的“再分化”能力。一个已分化细胞若要表现其全能性首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。再分化有两种途径，一种是器官发生 (organogenesis)途径，一种是胚胎发生(embryogenesis) 途径。前者具体包括：先形成芽，后在芽基部长根；先形成根，再从根基部形成芽；在愈伤组织不同部位分别形成芽和根，然后根、芽的维管束接通形成完整植株；仅形成芽或根（如茶树的花粉愈伤组织诱导器官分化时，往往只形成根，而芽的发生则十分困难）。在大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的，但在有些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组织阶段。3、愈伤组织形成的条件是什么？其形成过程分为哪几个阶段？ 形成条件： 在一个完整的植物中，每个分化细胞都是某个器官和组织中的一个成员，它只能在与其周围成员相互协调和彼此制约当中，恰如其分地发挥整个植株所赋予它的一定的功能，而不具备施展其全能性的外部条件。然而，这些细胞若是一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织。 大量的研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下都能产生愈伤组织。由此可见，愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。当然，外植体的类型(如木本植物中的幼态或成年态)和外植体原来在植株上所处的位置(它反映了内源激素的水平)对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。形成过程：愈伤组织形成的过程分为3个时期1诱导期诱导期又称启动期，是愈伤组织形成的起点，是外植体细胞进行分裂准备的时期。在这一时期，外植体上已分化的活细胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，外植体细胞大小虽然没有多大变化，但其内部却发生了生理生化变化，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。2分裂期经过诱导期之后，外植体外层细胞开始迅速分裂，但中间部分的细胞不分裂，形成了一个静止的芯。在这一时期由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率，细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，标志着细胞分裂进入了高峰期。外植体细胞由原来的静止状态经过诱导期的分裂准备之后进入分裂高峰，回复为分生状态，细胞进行脱分化。处于分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。如果在原培养基上培养，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累等，细胞将不可避免地发生分化，产生新的结构，而将其及时转移到新鲜培养基上（继代培养），愈伤组织可无限制地进行细胞分裂，维持其不分化的状态。3分化期（形成期）停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织(meristemoid)，称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，包围着内部已分化的管胞而成。以上对愈伤组织形成过程的时期并不是严格划分的，实际上，特别是分裂期和形成期往往可以出现在同一块组织上。细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。一些外植体的细胞脱分化后可直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。4、试述优良愈伤组织应用具备的特点及获得优良愈伤组织的方法。优良愈伤组织应用具备的特点：来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的23个特性：（1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。（3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。（4）经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。优良愈伤组织获得的方法：（1）选择适当的基因型和适当的外植体。虽然几乎所有高等植物的器官和组织都有可能产生愈伤组织，但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同，同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同，例如小麦和其他一些禾谷类植物愈伤组织培养的成功，在很大程度上是由于选择了未成熟胚和幼穗作为外植体，它们的根和幼叶虽然也能形成愈伤组织，但都是非胚性的。（2）选择正确的培养基，特别是正确的植物激素的种类和浓度，以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配比。（3）采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。主要根据对小麦、高梁和玉米等禾谷类植物体细胞愈伤组织培养的研究，王海波(1991)将愈伤组织分为3种主要类型：类型I结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型；类型结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快，称为亢进分裂型；类型结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，称为衰败型。类型I和类型之间在一定程度上可以相互转变，衰败型细胞在一定程度上也可得到控制。能够促成这种转变和控制的因子有几种，其中最主要的是植物激素和氮源形态。一般来说，生长素是促使细胞进入亢进状态的因子，细胞分裂素是促使细胞进入保守状态的因子。氮源除了供给培养物氮素营养外，还原态氮还具有促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。当增加生长素浓度促进细胞分裂的效果不明显时，增加培养基中的氨态氮(或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有机形式的还原态氮)可起到明显的促进分裂的作用；当使用细胞分裂素或降低生长素对细胞分裂的抑制效果不显著时，增加培养基中的硝态氮或减少还原态氮，可起到显著的抑制分裂的作用。5、影响茎芽分化的因素有哪些？（1）化学因素大量的实验证明，影响茎芽分化的化学因素主要是培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例，当生长素的相对浓度较高时，有利于细胞的增殖和根的分化，若细胞分裂素的相对浓度较高，则促进芽的分化，当这两种激素之间的比例适中时，则仍产生无结构的愈伤组织。另外，在烟草、紫雪花、秋海棠和水稻中，赤霉素对于茎芽的分化有抑制作用。在烟草中，若把正在分化的愈伤组织在黑暗条件下以GA3处理，时间即使短至3060 min，也会减少芽的分化，而且在处理之后48 h，所有的拟分生组织或茎芽全都不复存在。（2）物理因素：包括培养基的状态、光照、温度等。 White(1939)报道，在固体培养基上，粉蓝烟草郎氏烟草的组织培养物以一种完全无结构的状态生长，但在成分相同的液体培养基中，则能形成茂密的茎芽，这个报告后来虽然被Skoog(1944)所证实，但Dougall等(1960)却观察到，在以1琼脂固化的培养基上，烟草组织培养物形成了大量的茎芽，而生长在成分相同的液体培养基表面的组织却很少分化茎芽。在培养烟草组织薄层时，随着培养基中琼脂浓度的变化，形态发生的方式出现了令人惊异的改变。当琼脂为1时，只能形成花；随着琼脂浓度的下降，花的形成频率减少，营养芽的分化出现。在液体培养基中，这种组织则只能愈伤化和分化营养芽。 在由一个双单倍体马铃薯品种叶肉原生质体获得的愈伤组织中，只有在培养基里加入O.20.3 molL甘露醇以使渗透压保持在200到400毫渗透压摩尔时，才可能出现茎芽的分化。否则愈伤组织不能变绿，而愈伤组织变绿是芽分化的前提。 光照因素包括光照强度、光照时间和光的质量。高强度的光照对烟草茎芽的形成有抑制作用。天竺葵愈伤组织只有在光照和黑暗周期交替(1516 h光照最好)条件下才能分化茎芽，培养在连续光照下的愈伤组织总是白色的，不表现器官发生现象。光的质量对器官分化也有影响。在烟草中蓝光能促进茎芽的分化，红光能刺激生根。 在组织培养中对器官分化有明显影响的其他因子包括：培养材料的染色体组、供体植株和外植体的生理状态(分生细胞和胚细胞产生的愈伤组织具有较高的再生能力)、外植体的细胞发育状态、培养物的历史(反复继代保存后形态发生能力下降)以及内生激素水平等。第四章 体细胞胚胎发生1、植物体细胞胚胎发生的概念是什么？有哪些途径？（1）体细胞胚胎发生的概念 正常情况下，植物胚胎发生(embryogenesis)是指受精后的一系列连续过程，即从合子(受精卵)到成熟胚的发生、发育的有规律变化，这种情况下形成的胚称为合子胚。在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体。成熟的胚状体可以像合子胚一样长出根、芽，萌发再生植株。由单细胞或一群细胞被诱导不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育过程称为体细胞胚胎发生。植物体细胞胚胎发生具有普遍性。（2） 体细胞胚胎发生的途径由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种，即直接途径和间接途径。直接途径是指从培养中的器官、组织、细胞或原生质体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段(图 A，图 B)， 这种“胚性细胞”是在胚胎发生之前就已“决定”了的。间接途径是指外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎 (图C)。图 植物体细胞胚胎发生方式示意图A由外植体外层细胞直接产生体细胞胚；B由外植体组织内的细胞产生体细胞胚；c愈伤组织表层细胞分化为体细胞胚(引自王亚馥等，2000)多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。这种方式的胚状体形成通常分两个阶段完成：胚胎发生丛（embryogenic clump，EC）的形成。愈伤组织中常含有两种类型的细胞，一种具大液泡的细胞，通常失去胚胎发生潜能，在培养基中易散开；另一种液泡小、细胞质浓的小细胞，这种小细胞聚集为丛状，被称为EC。EC表面是高度分生组织化的细胞团，一个EC表面可产生大量的胚状体。如在胡萝卜属、毛茛属和柑橘属中已证明，每个胚状体来自EC表面的单个细胞。胚状体的发育。EC通常在原培养基上不能使其表面的胚状体发育，但EC可以增殖、崩溃而不衰。EC崩溃是由于EC中心的细胞增加，并膨胀使EC崩溃，崩溃后分生性的表面细胞结合成群，又形成新的EC。EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体发育。2、影响体细胞胚胎发生的主要因子有哪些？ 对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中的两种成分，即生长素和氮源。（1）生长素在培养基中添加生长素，通常对体细胞胚诱导是必不可缺少的。例如在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需的是一种含有生长素的培养基，通常所用的生长素是2，4D，浓度范围0.51 mgL。在这样一种培养基(增殖培养基)上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称做“胚性细胞团”(EC)。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低(O.010.1 mgL)或完全没有生长素的培养基(成胚培养基)上，它们就能发育为成熟的胚。在无生长素的培养基上连续继代培养的组织或愈伤组织一般不能形成体细胞胚。结论：在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。（2）氮源除生长素外，培养基中氮源的形态也会显著影响离体条件下的胚胎发生。体细胞胚诱导和成熟需要大量氮素，通常为还原态氮如铵盐。 例欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有一个最低数量的内源NH4存在(每千克鲜重的组织约5 mmol)。如果内源NH4达不到这个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要使细胞内NH4达到这个水平，不但需要有很少量的外源NH4存在(2.5 mmolL)，还需要供应相对浓度很高的NO3(60 mmolL)。（3） 其他因子据Brown等(1976)报道，在野生胡萝卜中，高浓度的钾(20 mmolL)是胚胎发生所必需的。在培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值(1.5 mgL)，否则将有利于生根，而不利于成胚。这是因为低水平的溶解氧在细胞内似乎会导致较高水平的ATP合成，高水平的溶解氧有利于生根。如果加入ATP，则有可能取代对低水平溶解氧的需要。此外，在培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率；某些组织释放挥发性和非挥发性物质到培养基中，能抑制愈伤组织中的体细胞胚胎发生。乙醇是这些挥发性抑制物质中的一种，非挥发性抑制物包括IAA、ABA和GA3。3、长期培养物形态发生潜力丧失的可能原因有哪些？有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官和(或)胚胎发生潜力，但经过反复继代保存之后，这种形态发生能力常常逐渐下降，有时甚至完全丧失。现在有3种假说解释这一现象。（1）遗传假说 培养细胞中细胞核物质变化，如多倍性、非整倍性和染色体结构突变，可能与长期培养物器官发生或胚胎发生潜能丧失有关。这种由遗传原因造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。（2） 生理假说在某些情况下，形态发生潜力的下降可能是由于细胞或组织内激素平衡关系的改变造成的，或是由于细胞对外源生长物质敏感性的改变造成的。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，有可能够恢复细胞形态发生的潜能(器官和胚胎分化)。如在无生长素的培养基中加入14的活性炭(如胡萝卜培养物)或者低温处理培养组织，能够恢复体细胞胚发生的潜能。（3）竞争假说 在复合多细胞外植体中，只有少数细胞能产生胚性细胞团，其余细胞没有细胞全能性。按照竞争假说，在有利于非胚性细胞生长的条件下，外植体中的非胚性细胞大量增殖，结果在不断反复继代培养的过程中导致胚性细胞逐渐消失。在这种情况下，恢复培养物的体细胞胚发生潜能是不可能的。但是，如果培养物中尚存少量胚性细胞，它们由于非胚性细胞的抑制作用，不能表达自身的细胞全能性，此时可以通过改变培养基成分，选择性地增殖具有胚发生全能性的细胞，有可能恢复培养物形态发生的潜能。4、愈伤组织培养中存在哪两种类型的细胞？它们的特点是什么？ 在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生长的解剖学和组织学的研究表明，在培养中存在着两种类型的细胞：自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，一般不具胚胎发生潜力；成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细胞，具成胚潜力。能够成胚的细胞团可称为胚性细胞团。在含有生长素的培养基中，胚性细胞团虽不能发育为成熟的胚，但它本身可通过细胞的增殖和细胞团的破碎不断延续。胚性细胞团在破碎之前包含两种不同类型的细胞；处在中央的那些细胞具有一个单个的大液泡，小而致密的核，核仁染色不深，核糖体数目不多，内质网体和正常线粒体很少，极少或没有类似圆球体的泡囊，脱氢酶活性很低，淀粉体数目减少。在胚性细胞团的外围，则是成群的非常活跃的分生细胞。和中央细胞相反，这些细胞的特点是具有若干个小液泡，一个大的弥散染色的核，一个单个的染色鲜明的核仁，核糖体密度较高，大量的粗糙内质网体，正常的线粒体，类似圆球体的泡囊，脱氢酶活性较高，以及十分显著的淀粉体。由于中央细胞体积增大，彼此分离，可引起胚性细胞团解体，这时外围的分生细胞离散成小团，之后每一个小团再发育成一个新的胚性细胞团。然而，若把聚成小团的分生细胞或新形成的胚性细胞团筛选出来，转移到不含生长素的培养基上，在它们的外层就会形成很多体细胞胚。通过外表面的角质化，体细胞胚和母体组织胚性细胞团之间很早就形成了明确的界限，但脱离胚性细胞团的时间可以在不同的发育阶段，一般多为球形期之后。体细胞胚一旦脱离母体组织，在悬浮培养中就成为一个自由漂浮的结构，在这种状态下继续进一步的发育。5、简述制造单胚人工种子的方法和工业化生产人工种子的步骤。通过用人工种皮包被体细胞胚而制造人工种子(或称合成种子)，用以繁殖遗传工程植物、减数分裂不稳定的基因型、自交不亲合植物、稀有的和珍贵的物种或远缘杂交种，以及通过人工授粉而得到的杂种等是当前的一个研究热点之一。人工种子由包裹在防护层中的体细胞组成，在制造单胚人工种子的时候，主要采用诸如藻酸钠一类的水凝胶作为体细胞胚的包被物质。藻酸钠(23.2，WV)在室温下为液体，很适用于制造人工种子。当体细胞胚与藻酸钠混合以后，再滴人到硝酸钙或氯化钙溶液(100 mmolL)中，30 min内表面即可完全络合，形成一层持久的种皮。此外，在种皮基质中还可加入一些对体细胞胚有益的物质，如能促进生长的微生物、营养物质、生长调节物质、杀虫剂以及用于旱地播种的亲水性化合物等作为人工胚乳。目前人工种子尚处于研究阶段，为了实现工业化生产，必须把几种性质各异的技术结合起来。首先，必须建立起适当的组织培养技术，从中能产生高质量的大小一致和发育期同步的、功能像合子胚一样的体细胞胚。为了促成体细胞胚的同步发育，现在常常采用的方法有以下3种：（1）在细胞培养初期，于培养基中加入DNA合成抑制剂如5氨基尿嘧啶等，使细胞分裂暂停，或将培养物置于低温之下，以抑制细胞分裂。一定时间之后，除掉抑制剂或转入正常温度下培养，以促使细胞同步分裂。（2）将培养细胞用不同直径的玻璃珠或不同孔径的尼龙网过滤，以收集不同发育时期的胚状体。（3）利用渗透压控制胚胎发育同步性。不同发育阶段的胚状体具有不同的渗透压，例如在向日葵胚状体发育过程中，随着胚由小到大，其渗透压由高到低，因此，利用不同发育阶段的胚状体对渗透压的不同要求，通过调节渗透压即可使胚停留在某一发育阶段。解决了胚的同步发育问题之后，还必须建立大规模自动化的液体培养体系，以便生产数量足够的体细胞胚。此外，生产具有适当水分含量的种皮的方法，掺入营养物质和其他附加物质的方法，以及用于包埋体细胞胚的设备等，也都有待改进。现在，有关人工种子生产的研究虽然已经证实了在整个生产过程中每一个步骤的可行性，然而，必须把这些步骤组织成一个完整的体系，这样才能把各种不同的组分加工成人工种子。当然，人工种子最终能否用于农业生产，还要取决于它的成本的高低。6、试述体细胞胚胎发生的实际应用。（1） 无性繁殖由于胚性细胞生长和随后的体细胞胚发育可以在液体培养基中进行，所以将体细胞胚发生与工程技术结合，可以建立大规模的机械化或自动化培养体系。这种培养体系能循环生产大量的繁殖体(体细胞胚胎)，且成本低廉。在重复体细胞胚胎发生(又称为副体细胞胚发生、不定胚发生或次级体细胞胚胎发生)的过程中，从原有的体细胞胚增殖体细胞胚，经过一次循环，可以形成体细胞胚无性系。（2） 人工（合成）种子的制备通过用人工种皮包被体细胞胚而制造人工种子(或称合成种子)，用以繁殖遗传工程植物、减数分裂不稳定的基因型、自交不亲合植物、稀有的和珍贵的物种或远缘杂交种，以及通过人工授粉而得到的杂种等是当前的一个研究热点之一。（3） 分离可再生的原生质体的材料 胚性愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚已作为许多植物原生质体分离的材料。这些培养体系中的细胞或组织在培养过程中表现出再生植株的潜能，为此，其原生质体也有形成完整植株的能力。在禾本科植物、松柏类植物和柑橘植物中，胚性培养物作为可再生的原生质体材料具有特别的价值。（4）遗传转化由于叶圆盘转化体系的出现，使成功培育遗传工程植物(烟草、苜蓿)成为可能，而这些植物的培养组织能够通过体细胞胚胎发生途径再生植株。在这些植物中，遗传转化从培养物分离的单细胞，然后将其培养在选择培养基上(营养培养基含抗生素、卡那霉素)，形成愈伤组织系，最后在除去生长素的培养基上形成体细胞胚。由于间接体细胞胚胎发生中愈伤组织阶段似乎很重要，所以不能排除从转化和未转化组织形成嵌合体细胞胚的可能性。为此，可以通过重复体细胞胚胎发生，绕过愈伤组织阶段。还有实验表明重复体细胞胚起源的表皮或下表皮单细胞，这些细胞很容易受到农杆菌的感染。因此，遗传转化技术应用于初级体细胞胚，而不是合子胚，是完全能产生转基因体细胞胚的。理论上，重