乳糖微生物限度检查法分析方法验证.doc

乳糖微生物限度检查分析方法验证方案2006年XX月验 证 方 案 起 草 审 批 表部 门姓 名签 名日 期起草人质量控制部审批人质量控制部质量保证部副 总验证方案目录1、目的 2、适用范围 3、接受标准 4、所需仪器校验情况 5、验证方法6、人员和职责 乳糖微生物限度检查分析方法验证方案1 目的：建立乳糖微生物限度分析方法，包括细菌数、霉菌数及酵母菌数的检查以及控制菌的检查，并对分析方法进行验证，以证明所采用的方法适合于乳糖微生物限度的检查，为日常的检测工作提供依据。2 适用范围：适用于进厂的辅料乳糖微生物限度检查。3 可接受的标准：3.1细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证可接受的标准3.1.1在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。3.1.2在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。3.2控制菌检查验证可接受的标准3.2.1阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组检出试验菌。3.2.2阴性对照应无菌生产，供试品应无菌生长。4 所需仪器校验情况：应有所需仪器检定时间、检定部门及有效期。5 验证方法：5.1 细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证（直接接种法）5.1.1试验用的菌种：（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44 102（3）枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CMCC(B)63 501（4）白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F)98 001（5）黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)98 0035.1.2培养基及稀释液培养基：改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液、PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.1.3 试验步骤5.1.3.1 培养基的配制和灭菌将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在121的温度条件下灭菌20min冷却后备用。5.1.3.2滤器及滤膜将试验所用的培养皿，研钵及其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，把试验用的滤器、手术镊洗净、擦干，放于带盖的容器内（瓷盒或铝制饭盒），盖严，用牛皮纸包裹好，将滤膜用纯化水漂洗后放入带盖的培养皿中，用牛皮纸包裹好放在高效灭菌器中，在121的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5.1.3.3菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，在3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，在2328培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，在2328培养57天，加入35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。5.1.3.4供试液的制备取乳糖10g，加入90ml PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中溶解，混匀，作为1:10的供试液。5.1.3.5具体操作a试验组 用吸管分别取上述1:10供试液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种试验菌平行测定两份。前3种菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。b 菌液组（测定所加的试验菌数）取和试验组一样多的试验菌加入平皿后培养。c 供试品对照组取和试验组一样稀释级别的供试液1ml，加入平皿中，平行操作4份，2份加入营养琼脂培养基并培养，另2份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。d 稀释剂对照组用吸管分别取稀释液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，置平皿中，每种试验菌平行测定两份。前3种菌营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。e阴性对照用吸管分别取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml置平皿中，分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基并培养。5.1.3.6 按5.1.3.5独立平行操作3份。5.1.3.7 培养及计数分别将玫瑰红钠琼脂培养基在 2328培养72小时，逐日计数，以72小时的菌落数报告，营养琼脂培养基在 3035培养48小时逐日计数，以48小时的菌落数报告。5.2控制菌检查的验证5.2.1试验用的菌种（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44 1025.2.2培养基及稀释液培养基: 营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液、PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.2.3 试验步骤5.2.3.1 培养基的配制和灭菌将营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在121的条件下灭菌20min冷却后备用。5.2.3.2试验用具将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，在121的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5.2.3.3 菌液制备 接种大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。5.2.3.4供试液的制备见5.1.3.4供试液的制备5.2.3.5 具体操作a 试验组 分别取上述5.1.3.4中1：10供试液10ml和含试验菌50100cfu大肠埃希菌的菌悬液，置于盛放有90ml胆盐乳糖培养基中。b 阴性菌对照组 分别取上述5.1.3.4中1：10供试液10ml和含试验菌50100cfu金黄色葡萄球菌的菌悬液，置于100ml的胆盐乳糖培养基中。c 阴性对照取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，置于100ml的胆盐乳糖培养基中。D 供试品的测试取上述5.1.3.4中1：10供试液10ml，置于100ml的胆盐乳糖培养基中。5.2.3.6 培养及计数将胆盐乳糖培养基放入培养箱中，在35-37培养18-24小时，必要时延长至48小时计数。 6 人员和职责：XXX：负责审核验证方案和报告，组织实施验证。XXX：负责验证过程中的具体操作及验证记录的完成。XXX：负责验证方案和报告的起草以及原始记录的复核。XXX：负责验证草案和验证报告的审批、验证过程的管理。XX：负责验证草案和验证报告的批准。 验 证 报 告 起 草 审 批 表部 门姓 名签 名日 期起草人质量控制部审批人质量控制部质量保证部副 总 验证报告目录1 目的2 适用范围3 接受标准4 所需仪器校验情况5 验证方法6 验证结果与评价7附录 乳糖微生物限度检查法分析方法的验证报告1 目的: 乳糖微生物限度检查法分析方法的验证已经完成，具体的验证结果和试验批号见下列报告。在以后的微生物限度检查中，乳糖微生物限度检查法按照验证的方法和实验条件进行操作。2 适用范围：适用于进厂的辅料乳糖微生物限度检查。3 可接受的标准：3.1细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证可接受的标准3.1.1在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。3.1.2在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。3.2控制菌检查验证可接受的标准3.2.1阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组检出试验菌。3.2.2阴性对照应无菌生产，供试品应无菌生长。 4 所需仪器校验情况。仪器型号校正时间有效期至生化培养箱LRH-250生化培养箱LRH-250超净工作台YJ-900超净工作台YJ-1450 检查人： 日期：5验证方法：5.1 细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证(平皿法)5.1.1试验用的菌种:（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44 102（3）枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CMCC(B)63 501（4）白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F)98 001（5）黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)98 0035.1.2培养基及稀释液培养基: 改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液, PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.1.3 试验步骤5.1.3.1 培养基的配制和灭菌将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在121的条件下灭菌20min冷却后备用。5.1.3.2滤器及滤膜将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，在121的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5.1.3.3菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，在3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，在2328培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，在2328培养57天，加入35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。5.1.3.4供试液的制备a取乳糖10g，加入90ml PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中溶解，混匀，作为1:10的供试液。5.1.3.5具体操作a试验组 用吸管分别取上述1:10供试液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种试验菌平行测定两份。前3种菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。b 菌液组（测定所加的试验菌数）取和试验组一样多的试验菌过滤后培养。c 供试品对照组取和试验组一样稀释级别的供试液1ml，加入平皿中，平行操作4份，2份加入营养琼脂培养基并培养，另2份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。d 稀释剂对照组用吸管分别取稀释液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，置平皿中，每种试验菌平行测定两份。前3种菌营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。e阴性对照用吸管分别取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml置平皿中，分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基并培养。5.1.3.6 按5.1.3.5独立平行操作3份。5.1.3.7培养及计数分别将玫瑰红钠琼脂培养基在 2328培养72小时，逐日计数，以72小时的菌落数报告，营养琼脂培养基在 3035培养48小时逐日计数，以48小时的菌落数报告。5.2控制菌检查的验证5.2.1试验用的菌种（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44 1025.2.2培养基及稀释液培养基: 营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基。稀释液：0.9%氯化钠溶液、PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5.2.3 试验步骤5.2.3.1 培养基的配制和灭菌将营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在121的条件下灭菌20分钟冷却后备用。5.2.3.2滤器及滤膜将试验所用的培养皿用不锈钢培养皿消毒桶盛放，其他所需用具和溶液用牛皮纸包好，在121的温度条件下灭菌20分钟冷却后备用。5.2.3.3 菌液制备 接种大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。5.2.3.4供试液的制备见5.1.3.4供试液的制备5.2.3.5 具体操作a 试验组 分别取上述5.1.3.4中1：10供试液10ml和含试验菌50100cfu大肠埃希菌的菌悬液，置于100ml的胆盐乳糖培养基中。b 阴性菌对照组 分别取上述5.1.3.4中1：10供试液10ml和含试验菌50100cfu金黄色葡萄球菌的菌悬液，置于100ml的胆盐乳糖培养基中。c 阴性对照取PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，置于100ml的胆盐乳糖培养基中。D 供试品的测试取上述5.1.3.4中1：10供试液10ml，置于100ml的胆盐乳糖培养基中。5.2.3.6 培养及计数将胆盐乳糖培养基放入培养箱中，在35-37培养18-24小时，必要时延长至48小时计数。 5.3测定结果5.3. 1细菌数、霉菌数及酵母菌数的验证结果营养琼脂培养基培养温度： 培养时间： 培养箱编号： 玫瑰红钠琼脂培养基培养温度： 培养时间： 培养箱编号: 试验项目菌落计数（CFU/皿）第一次第二次第三次平皿1平皿2平均值平皿1平皿2平均值平皿1平皿2平均值阴性对照供试品对照组营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基试验组培养基名称：营养琼脂培养基菌种及批号CMCC（B）44102(大肠埃希菌) CMCC（B）26003(金黄色葡萄球菌)CMCC（B）63501（枯草芽孢杆菌）培养基名称：玫瑰红钠琼脂培养基CMCC（F）98001（白色念珠菌）CMCC（F）98003（黑曲霉）菌液组培养基名称：营养琼脂培养基CMCC（B）44102(大肠埃希菌) CMCC（B）26003(金黄色葡萄球菌)CMCC（B）63501（枯草芽孢杆菌）培养基名称：玫瑰红钠琼脂培养基CMCC（F）98001（白色念珠菌）CMCC（F）98003（黑曲霉）稀释剂对照组培养基名称：营养琼脂培养基CMCC（B）44102(大肠埃希菌) CMCC（B）26003(金黄色葡萄球菌)CMCC（B）63501（枯草芽孢杆菌）培养基名称：玫瑰红钠琼脂培养基CMCC（F）98001（白色念珠菌）CMCC（F）98003（黑曲霉）5.3.2回收率菌种组名称菌回收率第1次第2次第3次大肠埃希菌稀释剂对照