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糖化酶的生产，分离纯化的过程生工（2）班 20090806210 朱玲玲 黑曲霉是我国生产糖化酶制剂的主要菌种。为了更好地开发利用我国的糖化酶资源, 我们对黑曲霉搪化酶进行了分离提资源, 我们对黑曲霉搪化酶进行了分离提纯, 得到了电泳均一的搪化酶, 并对其性质进行了研究。糖化酶（EC3.2.1.3）是应用于淀粉工业中最重要的一种酶, 能从淀粉的非还原末端依次水解-1 , 4糖昔键而释放葡萄糖。糖化酶（gluca mylase ） 又名糖化型淀粉酶（glueoamylase）或淀粉葡萄糖苷酶。其系统名称为淀粉1.4-葡萄聚糖水解酶。糖化酶是一种胞外外切酶，但其专一性低，主要是从淀粉链的非还原性末端切开-1.4-键。一般淀粉水解程度达80在日本市售的糖化酶制剂多由黑曲霉而来。有关糖化酶的纯化及特性鉴定, 文献中已有报道。主要用途是作淀粉糖化剂。在食品工业制造葡萄糖、麦芽糖、糊精糖浆和直链淀粉薄膜，改善面色质地，加工蔬菜、制造菜汁、菜泥。在发酵工业方面与-淀粉一起还广泛用在谷氨酸、柠檬酸发酵生产中，作为淀粉原料，代替了麦芽和液体，提高了淀粉利用率。在我国，糖化酶还用于处理原理，水解棉中的低聚糖，减少棉纤维的粘缠以利于纺纱。但由于材料及纯化方法不同, 结果亦不尽相同。文献中从黑曲霉粗酶液中分离糖化酶, 第一步多采用硫酸按分级, 而后透析除盐再进一步纯化。这样步骤繁多而费时。本文拟以黑曲霉糖化酶粗酶液为材料, 探索糖化酶简便而高效的分离提纯条件, 且利用多种方法对其性质进行了研究。（一）材料 菌种：黑曲霉CICIM GB0506( Aspergillus CICIM GB0506) , 携多拷贝糖化酶基因, 为本实验室前期构建的基因工程菌,实验室保存，备用。 保存培养基：麸皮：水=1：1， 1Kgcm 灭菌20分钟 查氏斜面培养基：0.3NaNO3,0.1K2HPO4,0.05KCl,0.05MgSO47H2O,0.001 FeSO47H2O,3蔗糖，1.5琼脂粉，自然pH,用于黑曲霉的菌种保存和活化培养。1 液体培养基为:0.5KH2PO4,2聚胨6碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖或木糖），1黄豆粉饼，自然pH。 活化培养基 : 采用TZ 培养基, 每升含有3g 牛肉膏、15g 蛋白胨、2g 酵母抽提物、2g NaCl、15g 淀粉、20g 琼脂, pH 5.8。 活化培养基 : 在CD 培养基中分别加入1% 玉米淀粉( CD1) 或 0. 2%酵母粉( CD2) 或两者的混合物( CD3) 。 种子固体培养基: 采用查氏固体( CD) 培养基。 种子液体培养基: 每升含有3g 牛肉膏、15g 蛋白胨、2g 酵母抽提物、2g NaCl、15g 淀粉、1g 琼脂, pH 4. 5。 摇瓶发酵培养基: 每升含有30g 玉米浆、30g 硝酸铵、100g葡萄糖, pH 5.5。在发酵培养基中接入8% 种子液,34、220rmin摇床发酵120 144h,三角瓶装液量为50mL250mL。（二）糖化酶的生产1.活化培养方法2将- 70 冰箱的黑曲霉重组菌甘油管保藏物适当稀释后, 涂布活化培养基及种子固体培养基各3 块, 34 培养72120h。以菌落大小及发酵摇瓶酶活值为指标, 检测活化效果。菌落大小为每块平板随机选取30 个菌落的菌落直径平均值,单位: mm。 2.种子液制备方法 以涂布活化培养基上挑出单菌落划线于种子固体培养基, 34培养72 120h; 从种子固体平板上挖4cm2 左右的琼脂块放入种子液体培养基, 34 以不同打散方式培养96144h。 3.打散方法 采用CD3 为活化培养基, 分别采用不同规格玻璃珠, 铁丝对菌丝体进行打散。以菌体浓度及发酵摇瓶酶活值为指标, 检测打散效果。菌体浓度值由种子液经稀释,分别涂布3 块CD3 平板计算得到的平均值, 单位: 105个mL。 4.酶活测定方法3 （1）钢圈法：5ml 3% 琼脂倒皿 再加5ml可溶性淀粉与3% 琼脂放入三个灭过菌的钢圈 分可溶性淀粉与3% 琼脂放入三个灭过菌的钢圈 分别滴入不同浓度的酶液定期测定透明圈直径。 （2）比色法：10ml 20% 可溶性淀粉 5ml 柠檬酸 PH4.8 （对照不加酶液，处理加1ml） 加1ml10%NaOH 终止反应，对照补加1ml 酶液滤纸过渡比色。 5.酶的纯化 将工厂生产的酶发酵液离心(4000r/min ,20 min ) 后, 将上清液置于布氏漏斗过滤, 滤液再离心( 15000r/min ，15min)上清液作为粗酶液。 取粗酶液50 m l , 加固体硫酸钱到50 %饱和度, 置冰箱过夜。然后于4 离心( 15 000 r/min ,20min), 取上清再加硫酸铁至75 饱和度, 置冰箱过夜后离心( 15000 r/ min) 将沉淀溶于20 ml 蒸馏水中。将所得到的酶液加到的流出, 最终收集到脱盐后的酶液 。将硫酸铵分级后的酶液置超滤器内(内装PM 一10 滤膜) , 用柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(0.05mol L ,pH7.6) 透滤, 然后进行DEAE 一纤维素柱层析。柱(2.2x25cm )用0.05 mol/L ,pH7.6 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液平衡。上样后先用平衡缓冲液洗脱至流出液光密度值(28 0 n m ) 最低, 然后改为pH 梯度洗脱(pH 7.6一3.4 的0.05 mol / L 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液) 洗脱速度为30 ml/h,7.5ml/管, 层析温度为4。 6.蛋白质浓度测定：蛋白质浓度测定用改进的Folin一酚法测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白质. 7.酶的纯度鉴定：4酶纯度鉴定采用垂直板型聚丙烯酞胺凝胶圆盘电泳和梯度电泳法9。圆盘电泳的浓缩胶为4.6,分离胶为7.7,交联度2.5,125V电泳10小时。梯度电泳的交联度为4-30，交联度4，电泳2500-3000伏特小时。电泳后均用考马斯亮蓝R250染色。（3） 工艺流程：选择菌种：黑曲霉种子扩大培养试管斜面菌种黑曲霉的保存液体深层通风发酵干燥过滤，离心测定蛋白质浓度和酶活力粗酶制剂酶纯度鉴定（四）产品检测：5 产品的鉴定：采用纸层析法和构型测定法。展层剂为正丁醇，吡啶，水；显色剂为4二苯胺丙酮溶液，4苯胺丙酮溶液，85磷酸，80显色10分钟。构型测定用旋光仪监测反应体系的旋光值变化来完成。在20ml反应体系中含0.5可溶性淀粉和约400IU的糖化酶。于30开始反应，同时测定旋光度变化。当旋光度趋于稳定时，加入0.4gNa2CO3,使反应液pH上升至约9-10，然后观察旋光度的变化。2011年9月5日参考文献：1乔殿华、唐国敏、钟丽婵等，黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究.高产及低产菌株糖化酶表达的总体分析和比较,微生物学报，1997，37（5）：349-3542宋毅、李松、王正祥，糖化酶生产菌株种子制备工艺优化J，生物技术，2009，19（6）：70-7