毛细管电泳三种前沿应用的简介.doc

毛细管电泳三种前沿应用的简介摘 要：CE 作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，近年来发展迅猛并得到广泛应用。而其与电化学发光及与质谱的联用，还有NACE的兴起更是拓宽了它的使用范畴，弥补了CE的一些缺陷。关键词：毛细管电泳，无水毛细管电泳，电化学发光，质谱毛细管电泳，亦称高效毛细管电泳，是以高压电场为驱动力，以毛细管作为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术1。CE作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，自上世纪80年代问世以来，得到了迅速的发展，其研究和应用涉及环境分析、药物分离、生化分析等几乎所有的分析领域，引起学术届，尤其是色谱界的广泛关注。这与它独特的优点是密不可分的: 高效（105TP/m-107TP/m）、快速（几十秒至几于分钟）；分离模式多,选择自由度大；分析对象广,小到无机离子大至整个细胞,具有“万能”的分析功能和潜力；操作可高度自动化；样品与试剂消耗量小、运转费用低,无环境污染问题等等2。本文将对毛细管电泳在与电化学发光及质谱方面的联用进行介绍，并对近年新兴的无水毛细管技术做一论述。1毛细管电泳电化学发光分离检测技术11电化学发光及CE-ECL简介3电化学发光(ECL)是一种在电场的作用下，在电极表面将电能转化为辐射能的化学发光方法。在ECL体系中，三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)是最常用的发光试剂。近几年，Ru(bpy)32+ 技术已经成功应用于CE，简称CE-ECL。CE-ECL主要用来检测胺类化合物，并且成功用于各种实际样品的分析。它具有以下的优点：操作简单、灵敏度高、分离效率高、分析速度快以及试剂消耗少等。12 CE-ECL的模式3CE-ECL主要有四种模式：管区带电泳-ECL(CZE-ECL)，胶束电动色谱-ECL(MEKC-ECL)，毛细管电色谱-ECL(CEC-ECL)以及非水毛细管电泳-ECL(NACE-ECL)。其中CZE-ECL最简单，也最常见。13 CE-ECL 技术的应用进展13. 1 CE-ECL技术在药物分析方面的应用CE-ECL技术在药物分析方面的应用进展迅速。有实验4采用毛细管区带电泳吡啶钌电化学发光技术分析了药物中的比索洛尔；也有实验4将SDS加入CE-ECL体系, 成功实现了去甲肾上腺素、脱氧肾上腺素和异丙去甲肾上腺素的分离检测。毛细管电泳与电化学发光淬灭效应的间接检测也被用于酚类物质的研究。13. 2 CE-ECL技术对中药分析的应用4CE-ECL技术被应用于对中药苦参中喹诺里西啶生物碱的分析及植物提取液中山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品的分析等。13. 3 CE-ECL技术在生物体液及其生化方面的应用4CE-ECL技术可用于喹诺酮类药物、阿莫西林的分析,也可用于尿液中药物的检测。14 小结CE-ECL联用技术以及该技术在分析化学、生物分析化学等领域的应用取得了重要的进展。它可用于对具有化学发光响应的药物制剂及药物在生物体内的代谢物进行分析, 为药物的分析提供灵敏的检测手段。今后对该技术的研究工作可能会围绕以下几方面展开4: (1)共反应剂与吡啶钌电化学发光共反应机理研究。对共反应机理的进一步研究,有利于提高电化学发光的选择性和灵敏度,同时拓展该技术的应用范围。(2)新的电化学发光共反应剂的研究开发；(3)CE-ECL技术新应用。CE-ECL技术在众多领域的应用所带来的潜在价值, 已引起了人们的广泛关注；(4)高通量CE-ECL分析体系的研究与开发。2毛细管电泳-质谱联用技术21 CE-MS技术简介自1987年首次提出CE-MS联用方法以来, CE-MS作为具有高分离效率和高灵敏度的方法, 其应用受到了广泛关注, 并在过去的20年得到了迅速发展。CE的一些常用分离模式, 如毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动色谱(MEKC)、毛细管电色谱(CEC)等,都在CE-MS中得到了应用。CE-MS联用分为在线联用和离线联用两种方式。CE-MS离线联用的关键是对已分离样品的有效收集;而且与离线联用相比, CE-MS在线联用具有样品损失少、自动化程度高、分析速度快等优点,其应用要比离线联用广泛得多。22 CE-MS接口技术的研究进展接口技术是实现CE-MS联用的关键所在。近几年来,关于CE-MS方法学的研究主要是关于新接口技术。该技术的研究使得CE-MS的联用更加方便, 效率更高。221 CE-ESI-MS接口技术 ESI方法的发现使得被分析物带上多电荷后采用质谱仪可以检测相对分子质量达几万甚至十几万的生物大分子。由于ESI自身的优势以及LC-ESI-MS接口技术的日益趋于成熟,使得CE-ESI-MS已成为CE-MS联用技术中占主导地位的方法。目前CE-ESI-MS接口主要分为鞘液接口和无鞘液接口两种7。（1）鞘液接口技术鞘液接口技术的优点在于通过提高样品流速使得喷雾更加稳定,有利于形成稳定的电流回路,同时可改变 CE运行缓冲液的组成,使其满足ESI源的检测要求。然而鞘液的引入会稀释样品, 使检测灵敏度下降。为此,有人设计了低流速(lowflow)鞘液接口5（如图1），以降低鞘液的稀释作用, 同时铂丝构成电流回路可以避免因流速低所造成的断流。最近, 又出现了一种将鞘液接口和无鞘液接口相结合的技术5（如图2），这种设计既可以消除因鞘液造成的分离完整性的下降, 又可以消除因无鞘液接口不能改变缓冲液而造成的磷酸根离子的离子抑制作用,综合了鞘液接口和无鞘液接口技术的优点。（2）无鞘液接口技术无鞘液接口技术不能像鞘液接口技术一样依靠稳定的喷雾实现电流回路,因此必须采用一些其他的方法来形成电流回路。（3）芯片CE-ESI- MS接口技术芯片CE与ESI-MS联用的方法主要分为两类:一类是将ESI源和CE微芯片整合在一起, 另一类是把毛细管喷雾器附加在 CE微芯片内。后者的应用更为广泛, 其优势在于更有利于装置的微型化。222 CE-ICP-MS接口技术ICP-MS是一种先进的痕量多元素分析技术。CE-ICP-MS具有分离分析速度快、灵敏度高、分辨率高、样品用量少等优点, 在金属及金属化合物的分离分析中扮演着重要的角色。迄今为止,主要有3种CE-ICP-MS接口技术: 无鞘液接口技术、鞘液接口技术和氢化物发生接口技术。23 CE-MS的应用及其进展231生物大分子及相关物质分析蛋白质、糖类、脂类等生物大分子通常基质复杂、目标化合物含量低、纯化和分析检测较为困难。CE-MS联用技术作为高分离能力和高灵敏度的手段能够很好地解决生命物质的分析问题。（1）分离检测及结构功能分析CE-MS联用技术不仅可对蛋白质、多肽和脂类等生物大分子分离检测，也可进行不同生物分子构型的分析。CE-MS的应用有助于了解分子的结构功能信息,为分子的鉴定提供依据。（2）分子间相互作用研究及代谢组学研究目前,对于生物大分子及相关物质的研究已不仅仅局限于单个分子的结构功能, 而是还要研究分子间相互作用以及代谢组学的问题, 从而深入认识生命过程。在分子间相互作用研究方面, CE-MS在实现分离检测的同时,还可给出结构信息,为分子间加合物的研究提供了有力的手段。CE-MS在代谢组学方面的应用主要是血样或尿样中氨基酸、核苷等小分子图谱的分析, 旨在从中筛选出生物标志物, 为疾病的诊断和治疗提供依据5。（3）其它除了大分子代谢物的分析, CE-MS还被用于细菌提取物的分析。通过对细菌代谢组学的研究,可以认识细菌能量摄取和生长情况, 从而为因细菌引起的疾病的治疗提供依据5。232 中草药及其他天然产物中活性和毒性成分分析中草药成分复杂,如何对其有效成分进行分析和质量控制一直是研究的难点。CE-MS除了在生命物质分析中起着重要的作用, 在中草药分析中的应用也日益广泛。Henion等首次用CE-MS技术对几种草药中的多种异喹啉生物碱进行了分离，并用四氢小檗碱作内标，对小檗碱和巴马亭进行了定量分析。Unger等对单萜吲哚生物碱(如氢化小檗碱、-咔啉生物碱和异喹啉生物碱)进行了分析。Sturm等分离了异喹啉类生物碱，对多种药用植物甲醇提取液中的异喹啉生物碱进行了鉴定。Madteus等引用CE-ESI-MS分离分析了莨菪碱和 莨菪胺，并用于实际样品的分析。Chen等用 CE-ESI-MS技术分析中药中的黄连碱、小檗碱和巴马亭，并用此对真假中成药进行鉴别；由于使用了 MS-MS多级质谱，因而可以追踪碎片离子中的母离子，从而对化合物进行更加确切的指认。Armendia等则报道了采用CE-MS技术以负离子检测模式分析黄酮类化合物，在定量的同时对每种成分的结构进行了解析。Feng等报道了用CE-MS分析中药马钱子与乌头制剂中的生物碱。Edwards等用CE-MS在l0 min内分析了降血糖植物金雀花(Genista)tenera中的26种成分6。24 小结CE-MS联用技术大大拓宽了CE和MS本身的应用领域，但CE固有的缺陷并未克服7。对于CE-MS未来的发展趋势, 主要仍将集中在提高CE的分离能力、新接口技术以及应用研究方面5。3非水毛细管电泳毛细管区带电泳(CZE) 既可以使用水相缓冲溶液，也可以使用有机相缓冲溶液进行分离。在有机溶剂中进行的CZE分离常被称为非水毛细管电泳( Nonaqueous capillary electrophoresis，NACE) 。31 非水毛细管电泳的优势有机溶剂一般具有以下特性8：液体；溶解性好；化学稳定性；挥发性低；与设备要求相符；价格合理，纯度合适；足够的相对介电常数；黏度低。目前，常用的有机溶剂主要有9：甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、正丙醇( 1- PrOH)、异丙醇( 2- PrOH)、醋酸( HAc)、甲酰胺( FA，沸点 210) 、N-甲基甲酰胺( NMF，沸点199201)、 N，N-二甲基甲酰胺( DMF， 沸点153)、二甲基亚砜( DMSO)、和乙腈(ACN) 等。有机溶剂种类繁多，而且它们的物理化学性质各不相同 。NACE 可以针对被分析物的性质，选择不同的有机溶剂或混合有机溶剂。与水相CZE相比，NACE 主要有以下优势: 可使用超大内径的毛细管柱、实现快速分析， 能够降低吸附以及提高分离选择性等。另外，它在分析难溶于水的物质、在水中不稳定物质、中性物质以及手性物质分析方面显示了独特的优势。311 使用超大内径毛细管柱在NACE中，由于离子对和供体-受体作用的存在，使得电解质的解离程度减小以及离子电导率降低，从而导致电泳电流减小，焦耳热降低。因此，可以使用超大内径的毛细管柱作为分离通道，从而提高样品的载量。在NACE中，所使用的毛细管柱的内径可达到530m9。312 快速分析在NACE中，分离高压所引起的电泳电流较小，因此可施加高的分离电压来进行快速的分析。有实验9将 NACE 用于人尿样中磷脂酰乙醇的快速分析。结果显示，在2. 5 min 内就可实现此化合物的分析，分析速度比常规的色谱法提高了10倍。由于磷脂酰乙醇是一种乙醇摄入的生物标记物，可在乙醇存在的情况下，通过转磷脂酰反应在生物体内产生此外，它在生物体内的存留时间特别长。因此，可以通过检测磷脂酰乙醇来确定乙醇的摄入量。313 降低吸附 NACE 能够降低表面活性剂的团聚以及在毛细管柱内表面的吸附，可用于一些阴离子和阳离子表面活性剂的分析。314 提高分离选择性 在NACE中，有很多有机溶剂可供选择，这些有机溶剂的介电常数、粘度及接受或提供质子的能力等物化性质与水相相比有很大差别。通过选择合适的有机溶剂或混合有机溶剂，NACE可以提高对被分析物的分离选择性。这是因为改变有机溶剂不仅可以改变被分析物的离子半径，而且还可以改变被分析物的pKa，从而使得被分析物的淌度产生较大的差别。此外，通过改变有机溶剂中支持电解质的组成，利用有机溶剂中的离子对和共轭作用，也可以提高对被分析物的分离选择性。315 有利于难溶于水及在水中不稳定的化合物的分离由于水分子之间所形成的复杂三维网状结构，使得尺寸大的离子或分子很难在水中溶解。而对于分析这些难溶于水的物质，NACE显示出了非常大的优势。它已被成功用于分离难溶于水的磷酸酯、聚合物、脂肪酸、染料、有机汞、疏水多肽、有机磷杀虫剂、及疏水药物等。最近，有实验9将NACE用于药片中类固醇的分析，克服了类固醇药物在水中溶解度低的缺点，并缩短了分析时间。NACE还可以用于水溶液中不稳定的化合物的分离检测。例如青蓝染料和托品烷生物碱9。316 对中性物质的分离水相CZE只能分离带电荷的物质，而不能分离中性物质。NACE可实现对中性物质的分离。NACE分离中性物质的原理有两种: a.通过改变被分析物的pKa，可实现化合物的分离检测，如乙酰胺苯甲酰胺4-硝基苯甲酰胺硫代乙酰胺和丙烯酰胺等酰胺类; b.通过改变被分析物与添加剂之间的相互作用(离子对或异共轭作用等) ，可实现中性物质的分离，如稠环芳烃、芳香醇、酚类、羧酸及咪唑等。317 对手性物质的分离在手性电泳分离中，最常用的手性选择试剂是环糊精(CD)及其衍生物。在水溶液中，手性分离的原理主要是依靠CD与分析物之间的憎溶作用(Solvophobic interaction)。而以有机溶剂代替水进行NACE手性分离，能够改变手性识别和分离的机制。首先，溶剂的改变会引起其它因素的变化，例如粘度电渗流离子半径解离常数以及被分析物与添加剂之间的作用等，同时这些因素的改变也会影响分离的选择性。其次，在有机溶剂中，憎溶作用较弱，但其它作用都比较强。在有机溶剂中，虽然CD与分析物之间的憎溶作用减弱，但是CD上的羟基基团与被分析物所形成的离子-偶极作用增强，这也可以提高分离选择性。另外，CD在溶剂中的溶解度差别很大。CD 在水中的溶解性较差，例如9，在25，-CD在水中的最大溶解度仅为163 mmol /L，而在NMF中的溶解度大于700 mmol /L。在这样的有机溶剂中，使用高浓度的 CD，也是分离选择性提高的原因之一。32 NACE的检测方法目前，与NACE联用的检测器主要包括紫外可见光谱法(UV- visible spectroscopy，UV)、荧光检测(Fluorescence，FL)、电喷雾电离-质谱检测( Electrospray ionization- mass spectroscopy，ESI- MS)、电化学检测(Electrochemistry，EC)、电化学发光/电化学双检测( Electrochemiluminescence/EC，ECL/EC)以及化学发光检测(Chemiluminescence，CL)等。针对有机溶剂的特性，可以选择不同的检测方法。321 紫外可见光谱法(UV)在水相 CZE 中所使用的毛细管柱的内径比较小，使得光程较短，从而导致UV检测方法的灵敏度降低。而NACE具有电泳电流低的优点，为了增加光程长度，可以使用大内径的毛细管柱(200或300m)作为分离通道来进行NACE-UV分析，进而提高灵敏度。但缺点是会产生虹吸效应，使得分离效率变差。若以适当速度提升进样容器液面高度可消除虹吸现象。322 荧光检测(FL)在FL和激光诱导荧光( Laser induced fluorescence，LIF)检测中，为了得到高的灵敏度，必须降低荧光团的猝灭程度。溶剂的粘度和极性是影响猝灭的两个重要因素10。FL在不同溶剂中的强度顺序是:DMFDMSONFMMeOH/DMF(11，V/V)FAMeOH/ACN(11，V/V)水。最近的研究结果显示，与水溶液相比，MeOH- ACN混合溶剂对荧光生物碱和衍生儿茶酚胺的FL检测具有很好的增强作用。323 电喷雾电离-质谱检测(ESI-MS)MS可与CZE离线、在线联用。要实现MS和CZE的在线联用，必须使用电喷雾法进行电离。在CZE-ESI-MS分析中，如果使用有机溶剂代替水，将更有利于电喷雾电离操作。此外，NACE 中低的电泳电流使得ESI-MS系统更稳定。MeOH-ACN的混合溶剂是NACE-MS分析中最常用的溶剂。在NACE中，由于使用了挥发性的有机溶剂，更有利于电喷雾电离操作。因此，与CZE-ESI-MS得到的结果相比，NACE-ESI-MS检测具有更好的稳定性和更高的检测灵敏度。324 电化学检测(EC)与水相CZE相比，NACE更适合于EC检测。一方面，NACE 具有较低的电泳电流，对EC检测影响较小在没有场隔离器的情况下，可以使用大内径的毛细管柱(75m)作为分离通道。另一方面，在一些有机溶剂中，电化学窗口比较宽，更利于EC的检测。325 电化学发光/电化学双检测(ECL/EC)有研究9将NACE与ECL/EC双检测技术相联用(NACE-ECL/EC)，并将其用于实际样品中药物及中药中主要活性成分的分析。被分析的物质包括结构相似的吩噻嗪类化合物以及在水中不稳定的托品烷类生物碱。所使用的有机溶剂可以是纯乙腈，也可以是乙腈与异丙醇组成的混合溶剂;所使用的分离毛细管柱分别为33cm75m和18cm25m。此法显示出了以下优点: 无需场隔离器下，可以施加高的分离电压以及使用短且内径大的毛细管柱，从而提高了分析速度;由于实验中使用了有机相缓冲溶液，电极不容易受污染，不需要活化处理且稳定性好; 实现了在水中不稳定物质的分离; 更重要的是，ECL /EC双检测技术不但可以针对被分析物的性质不同， 选择不同的检测器，提高灵敏度，而且可以给出关于被分析物的ECL及EC双重信息，更有利于复杂体系中被分析物的鉴别和检测。326 化学发光检测( CL)Tsukagoshi等9使用过氧草酸酯作为化学发光试剂，ACN和水组成的混合溶液作为电泳分离缓冲溶液，对15种酚类化合物进行了分离检测，检出限比用传统荧光方法得到的结果低一个数量级。最近，肖全伟等9采用ACN- MeOH混合有机溶剂作为溶剂，成功地分离检测了食品包装材料中的有毒酚类化合物。33 NACE中的富集方式为了进一步提高检测的灵敏度，NACE常与一些富集方式结合起来。这些富集方式主要包括进样前的样品富集(柱前富集)和进样后的样品堆积(柱上堆积)。采用柱前富集和柱上堆积技术会大大提高分析的灵敏度。34 NACE 在实际样品分析中的应用NACE在植物提取液等复杂体系分析中具有非常重要的应用9。复杂体系样品通常需要使用有机溶剂进行液-液萃取或固相萃取操作。若使用水相CZE，需去除萃取后的有机溶剂，使溶质重新溶解在水中; 而当使用 NACE 时，蒸发步骤可省略，简化了操作。此外，NACE在中药分析中也有应用9。中药及其制剂的组分复杂，其分析对象为化学成分复杂的混合物，这些化合物中有已知及未知成分，不确定因素多；组分大多在水中溶解度不大，且有效成分含量一般较低；需经过繁琐的预处理过程以排除干扰组分的影响因此，中药分析难度大、问题多，对药物分析者极具挑战性。而NACE法分离效能高、分析速度快、应用范围广、样品用量少、预处理简单，是中药及其制剂分析的有效方法。例如，NACE可以进行生物碱类组分的分析、黄酮和香豆素类组分的分析及磷脂类、蒽醌类、多酚类、醇酮、醛酸类等组分的分析8。35 小结与水相CZE相比,NACE不论在分离还是与检测器联用等方面都显示出了非常独特的优势。未来NACE的主要的研究方向是9：探索使用离子液等新型的支持电解质或添加剂，以为 NACE 注入新的活力；用NACE 结合各种柱前或柱上富集方式，将其应