鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤.docx

从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离 将45 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。 2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析 1. 吸附： 将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中， 缓慢搅拌吸附6 h。2. 洗涤、洗脱： 待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol L pH 值为65 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min， 使溶菌酶从树脂上洗脱下来， 收集洗脱液，4冰箱静置过夜。第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1透析除盐、去碱性蛋白： 4条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8090，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2聚乙二醇浓缩： 盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋， 在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液； 3冷冻干燥： 用3 mol L 盐酸调pH值至50，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。溶菌酶纯度检测SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 凝胶板的制备： 用30分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10SDS、1TEMED、重蒸馏水、10APS 溶液配制而成； 溶菌酶的处理： 用磷酸缓冲液制成50 g mL 的溶液，取1080 L 点样于凝胶板上 电泳： 电流为10 mA，时间4 h； 固定、染色和脱色： 电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡1030 min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。 周五周六周日鸡蛋处理1h树脂吸附6.5h洗涤洗脱 2h凝胶溶胀透析除盐24h装柱5h聚乙二醇浓缩4h冷冻干燥3h层析 4h凝胶检验4h第一天鸡蛋处理：a) 将45 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0）。b) 量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等。c) 向透析清液中慢慢加入1 mol L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至89，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）树脂吸附：A. 将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中(抽滤去除缓冲液)， 缓慢搅拌吸附6 h。B. 3000r/min离心15min，将蛋清回收，用去离子水反复冲洗，直至洗液无浑浊，滤干树脂。C. 用等体积的0.15mol L pH 值为65 的磷酸缓冲液洗涤。D. 用等体积的0.15mol L pH 值为65 的磷酸缓冲液洗涤15min，重复2次，最后一次除去树脂水分。E. 加入等量的10（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min， 使溶菌酶从树脂上洗脱下来， 抽滤收集洗脱液。F. 每83ml洗脱液加32克细磨的固体（NH4）SO4 ,缓慢加入（NH4）SO4搅拌待完全溶解后，封口4冰箱静置过夜。凝胶溶胀：1) 称取7gSephaexG-75于250ml烧杯中，加入洗脱液140ml，室温溶胀2天。第二天透析除盐：1) 第一天的洗脱液会有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r / min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品。2) 将上述沉淀用1ml蒸馏水分两次洗下，装入透析袋。3) 4条件下，用去离子水透析，期间多次换水，直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。到此为止所有的试验项目均是有两个平行凝胶层析：测柱床总体（Vt）：1取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在距柱上端约3cm处作一记号。2关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口。3然后用量筒接住柱中去离子水（水面降至层析玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。装柱：4在柱中注入已脱气洗脱液（约1/3柱床高度）。5将溶胀好的凝胶与洗脱液1：3混匀稀释后缓慢倾入柱中。6待凝胶沉积约1cm2cm高度后打开出水口，常压平衡，胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。7然后关闭出水口，静置过夜，等凝胶完全沉降。过夜后的凝胶柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，连接处无死体积。第三天聚乙二醇浓缩：1) 离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol /L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8090，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2) 盐析物用1 倍体积去离子水，溶解成稀糊状，装入透析袋， 在装有淹没西的聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液。时间在67小时。冷冻干燥：1) 用3 mol L 盐酸调pH值至50，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。凝胶层析：预加样：1在胶面上覆盖一层滤纸，接恒流泵，用2倍床体积的洗脱液以0.5ml/min流速平衡柱子，使柱床稳定，期间测定流速是否与预设的一样，并赶走系统中的气泡。2用另一支相同的层析玻璃管与层析柱对比得到外水体积为26.5ml。3吸去柱上端的洗脱液，打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（不要干胶），关闭出水口。4用细滴管吸取1.0 mL蓝色葡聚糖-2000沿管壁缓慢加入，打开出水口，等蓝色葡聚糖渗入胶床与胶面相切时，关闭出水口。5用少许洗脱液加入柱中，柱上端再用洗脱液充满后用0.5mL/min的速度开始洗脱。6收集洗脱液没管1.0 ml。手动记录时间与对应的OD280并绘制曲线。葡聚糖色带狭窄、均匀平整，层析柱性能良好。蓝色葡聚糖洗下来之后，用洗脱液(1倍床体积)继续平衡一段时间。 加样和洗脱：7按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶样品溶液1.0 mL，用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件，以约0.5mL/min的速度洗脱并收集洗脱液每管0.5 ml。8手动记录时间及检测到的洗脱液在A280nm处的吸光值。9将收集管编号置于4 冰箱保存.合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液。（预先测得记录仪至部分收集器的死体积，出现峰值处的收集管延迟死体积所占的管数才为峰值处样品。）SDSpage电泳：制胶将12%的分离胶加入到电泳槽内的两玻璃板之间，到上口约3cm止，再加一薄层蒸馏水填满，赶走气泡，水与胶面分开并且界面清晰。静置20min，将水倒去。将 4%的浓缩胶连续平稳加入至刚刚没过薄板，赶走气泡。迅速从左至右插入梳子，不要留下气泡，静置30min。 点样将样品与loading Buffer 1:1混匀。将上述处理的各级分样品和蛋白Marker分别加到点样槽中5u