5-羟色胺对蚂蚁采食行为的抑制.doc

5-羟色胺对蚂蚁采食行为的抑制91.介绍 喂养是一个非常复杂的行为，他的调控需要多种不同因素的共同整合。不仅如季节、时间、食品质量等外部条件决定一个动物的采食行为而且生理状态也是。在脊椎与无脊椎动物的许多行为和生理过程中，生物胺发挥着重要的调节控制作用。特别是单胺5-HT（所有具有神经节的动物都具有)在不同类线虫和人类以相同形式编排多样行为和过程控制能量平衡。而在脊椎动物中，一元胺可以作为神经递质，神经调质或神经激素，在中央或外周水平发挥到他的作用。在对不同昆虫进行的药理学实验证明，淋巴或5-HT神经的改变会改变动物的摄食行为。在果蝇中，管理5-HT促进蔗糖消费的减少，他已经证明，这种影响可能是由于减少蔗糖的灵敏度。提高昆虫的蔗糖响应阈，因此也就减少了其食物的摄入量。5-HT对昆虫摄食的力度和效果底层机制还未被确定，5-HT仅仅影响食物消费总量吗?或者说在中央或外围水平5-HT可以在喂养设备的活动物中行动。在一些昆虫种类进行的免疫化学研究发现，血清素系统在主中心的控制喂养和唾液腺口器和消化道。这有力的表明，5-HT在摄食控制盒一体化进程中的调制中起重要作用。然而，苯胺的分布和功能在不同物种间分布不同。昆虫通过吮吸泵实现液体的摄入，其解剖被形容为2个蚂蚁物种：Lasius尼日尔，和Pachycondila簇毛麦。它由两套不同的肌肉扩张，回缩咽颊管组成。肌肉的回缩育扩张，扩大咽产生负压驱动器流体进入口腔。吸血泵活性是nectivorous蚂蚁和camponotus 蚂蚁所具有的特性。这种蚂蚁能够改变蔗糖溶液摄入的速度主要取决于种群糖的饥饿水平。碳水化合物缺乏的蚂蚁通过增加泵的频率来达到更高的摄入率。而且对于一个给定的浓度同时保持几乎恒定的每泵收缩所采取的体积。虽然一直研究蚂蚁摄食行为和摄食控制的许多方面，但没有关于在昆虫中5-HT与摄食相关的有用信息。考虑摄食调制作用的生理状态，目前的工作目的是：（1） 为了分析胺对摄食行为和吸泵活性的影响，所观察到的效果是否是由于蔗糖感知的变化（2） 通过免疫组化学技术研究5-HT与消化道吸泵，肌肉及在喂食中所设计的主要神经中枢的关联。2.材料与方法2.1 昆虫 由1000只蚂蚁组成的六个蚁群。实验中用到一个活更多的王后。这些蚂蚁在阿根廷布宜若斯艾利斯和圣地亚哥德尔艾斯特罗省不活并运送到实验室。每组蚂蚁呗饲养在有塑料盒做成的人工巢或容器中。（30*50*30cm）其基部涂有石膏，墙壁涂有聚四氟乙稀纤维来防止动物逃跑。蚂蚁种群被放置在桩压克力板，她们在容器中可以得到新鲜水，蜂蜜水喝切碎的昆虫碎片。好在自然光/黑暗的循环周期中保持一年并且接近恒温（23+3）之前的行为实验中，六个种群被进行了为期5-15天的碳水化合物饥饿实验。免疫组化学实验在维尔兹堡大学进行。在布宜若斯艾利斯大学校园拍摄的2个C.mus蚂蚁被转运到这个实验室，并保持几个星期。知道试验在25摄氏度。50%RH，12:12h。光/暗周期，自由获得蜂蜜水。2.2 摄食行为实验 2.2.1 采食行为实验 有关于蔗糖溶液喂养期间蚂蚁的吸泵活性的记录。在以前的作品中以描述的形式出现。简单的说，这个实验装着有一个木质平台（是一个覆盖湿滤纸和金属网的表面）制成并进行记录。一个移液管（0.5ml）被放置在正中心，并插入中空，使管的末端接触金属网。管中充满了30%w/w的蔗糖溶液，一点点下降，直到顶端暴露，脱离由一层条体凝胶覆盖的网格。同时，一个点击被固定在金属网，而另一个与溶液接触。当蚂蚁站在网格上并用其口器接触溶液时，电路闭合，允许蚂蚁采食所产生的信号的记录（带通滤波器，amplified 210 ; band-pass filter 0.417 Hz, 3 dB; sampling rate:200 Hz）这个记录被观察并记录存储在装有模拟-数字转换器的个人电脑中。（ADC-212，微微科技有限公司，英国） 实验在不同的日子里的一天内相同时间点对不同种群的蚂蚁进行，每次试验前，一组的十只蚂蚁被允许在实验装置喂养以建立对蔗糖溶液信息素的追踪。事后，实验用的蚂蚁被单独放在平衡的木桥上（9cm*0.2cm）已记录蚂蚁的质量（初始质量）。这座桥在接触通向有蔗糖溶液记录器的平台。一旦放上去，蚂蚁为了发现并得到溶液，并没有感到不安，当蚂蚁将口器深入到溶液，记录开始。实验所提供的溶液的总的量总是比单个蚂蚁一次性所摄入的量大。当蚂蚁喝饱后返回到木桥，它的质量重新被记录（最终质量）。记录完成后，将这些蚂蚁同它们的同伴分离开指导实验结束。 2.2.2摄食行为的变量和参数 摄入溶液的体积计算方法为（摄入溶液的质量/摄入溶液的密度），喂养的时间（s）代表电信号的持续时间，恰好与蚂蚁和蔗糖溶液接触时间相一致。那么（摄入率=摄入体积/摄入的时间）采食的主频率被定义为在所分析所有完整的信号得到的周期图中出现的最高峰。主要频率*摄入时间=泵在整个吸泵过程中的总收缩量。最后，每泵收缩量=总收缩量/摄入溶液的总量 2.2.3服药/管理药品 考虑到蚂蚁的摄食行为有激素状态调控，为了做到非侵入并减少程序的操作动物。我们采用口服药物，将5-羟色胺溶液在30%或20%w/w的包含10mm抗坏血酸的蔗糖溶液中，这主要是为了减少5-羟色胺的氧化，溶液配置好后，储存在10摄氏度环境中（不超过10天），在使用前，解冻5min。根据这个实验，蚂蚁以单体或群体形式喂养控制溶液（蔗糖和抗坏血酸）或添加不同数量的5-羟色胺的蔗糖溶液（详见2.2.4）：时间依赖型的影响 首先我们要确定所需C.mus-蚂蚁口服接种5-羟色胺所产生效应的时间、同一个群众中的蚂蚁被分隔直径3厘米的水瓶中。用0.25ul，30%w/w葡萄糖溶液喂养为对照组。用0.25ul的5-羟色胺浓度为0.075M为C.mus-蚂蚁的实验组。只有蚂蚁所提供的标量用于实验。此后(每只蚂蚁放置在大木桥上)经行记录（从40分，6.30起记录，冬季，早9.0010.00）卡尔的活动被记录在sucking-pump摄入的30%，w/w蔗糖溶液。为了增加记录数量确保一个良好的time-resolution，我们没有对对蚂蚁侧重之前或在这种分析方法喂食物。 想对于第一个实验的结果，我们在另一个地方进行第二个实验。考虑到先前研究对社会昆虫做了生物胺的口服接种，（Schulz和Robinson，在2001年.Barronel,2002年 Barron和Robinson，2005年）我们决定用以上研究步骤经行实验。把实验蚂蚁分为两组（N=40）其中一组喂养美联储10ul（相当于每只蚂蚁喂养0.25ul，30%的w/w葡萄糖溶液）。另一组喂10ul，5-羟色胺溶液0.075M（开始于，夏季 早上11：00）以上操作进行治疗的每一组，troph-allaxis要被确认为发生在这一组没。喂养行为和脑电活动有suking-pump记录下来。记录时间从3:30-5:30。每个个体在喂养时要进行测量。 ：剂量依赖效应的影响. 蚂蚁分别放置于水瓶中经口服治疗给0.25ul的30%w/w葡萄糖溶液的方案或一个5-羟色胺溶液0.00075.0.0075，0.075M。记录经行治疗时间大约4小时后（开始于 夏季 早10:00-12:00）蚂蚁的才是前后要侧重。2.3控制蚂蚁运动活动 控制活动是为了测量喂5-羟色胺是否影响蚂蚁活动和产生设么样的影响。蚂蚁被逐个处理（夏季 早 9:00-10:00）0.25ul，30%w/w的葡萄糖溶液或5-羟色胺溶液0.075M。1或4小时候进行估计。之后这些蚂蚁被逐个放入一个圆形竞技场直径7厘米和一个网状格子边长1.5厘米，并记录第一分钟的现象。于东估计是第一分钟内通过网格线的蚂蚁的数目。2.4 控制2 蔗糖接受阈值（SAR） 蔗糖口味测试，是为了分析在记录中喂养5-羟色胺行为变化是由糖感知变化引起的。蚂蚁群被安置在一个单独烧瓶中。经口服接种0.25ul，20%w/w葡萄糖溶液或5-羟色胺0.075M。约2小时治疗后，蚂蚁逐个放进艾本德试管中，麻醉并在冰上放置40-50分钟。蔗糖口味测试评价了1小时后，最后一只蚂蚁的重量。因此SAT的测试4小时后进行。2.4.1 蔗糖接受阈值SAT的测量 蔗糖接受评估的发生通过了量化，利用蚂蚁的舔的行为（Falibennehe和Josens，2011）。唇的接触利用一根熏牙签用（0.3%，1%，3%。10%，30%或50%.）w/w蔗糖溶液，用升序排列浓度，在第一个刺激实验和后每一个试验之后用应对水。刺激时间间隔为4到5分钟，这些蚂蚁接触刺激导致接触须的延长上颌复杂的唇解决方法被应用。蚂蚁的舔的行为联系被认为是积极的，而蚂蚁既没有揭露复杂的行为也无舔的行为被认为是负面的。对蚂蚁进行测试直到蔗糖浓度首次正面回应。即蚂蚁舔的行为反应蔗糖浓度的指标，用0.3%。1%，2%，3%，10%，30%，50%，60%浓度。蔗糖进行刺激，没有反应的蚂蚁要被淘汰。2.5 免疫组化2.5.1 消化道 主要对象（头宽2毫米）吃饱的蚂蚁群被麻醉并砍下头，头和身体用石蜡固定于牙签上，包括消化道，肠等。用冷冻方法解决（4%甲醛在磷酸盐，PBS，PH=7.2，4，组织被冲洗）1 ：0.1PBS 30分钟。2：:02PBS。TritonX-100（PBST，20分钟）洗完后，在室温孕育在杨消化道2%PBST血清（NGS，ICN，Biomedicals，NO.191356.Orsay.Franc）一小时，然后准备孕育在PBST图抗血清的主要抗体（1:2000，Diasorin，斯蒂尔沃特，锰，猫20080号，地下编号051007）2%农商一室温下2小时，在2下4天，孵化后组织在PBS洗10分钟和福陆公司在Alexa培养羊抗兔二抗（1:250，分子探针，在PBS-11008）1%农商一，在4洗一次10分钟。2.5.2 SEG和FG 去2只蚂蚁麻醉并斩首，投用石蜡固定在呀签上固定，并进行解剖，侵泡与Ringer溶液，并固定4过夜。头部组织首先在PBS30分钟。事后把他们放入2%的NGS和PBST在孕育室内1小时。整个安装准备在PBST孕育室温，以免疫血清为主，抗体（1:4000）在室温2小时用2%NGS，PBST（1:4000）孕育，组织用PBS10分钟和培养568-标记Alexa.Fluor抗兔二抗（1:25，分子探针。-21124）在PBS，1%NGS，4过夜，筹备工作。培养在Sytox绿（2.5毫米，分子探针，-7020）PBS3小时从3.30室温和染色随后用PBS洗10分钟2.5.3 安装，图像查看和处理 消化道和大脑用乙醇（30%，50%，70%，90%，95%，100%，脱水 10分钟）在甲酯（M-2047，Steinheim,SiymaAldirch公司，德国）安装在特殊的铝滑动由玻璃盖盖玻片中央洞中双方。准备用特殊显微镜用共焦刺激光扫描。（Leica，Tcs，sp 由德国，来场公司，为此拉尔）不同的物镜（100，10，0.4和20.07 NA，imm和40，125）消化道的扫描用488mm激发波长和2um的光学部分吸泵结构，可见化使用表用表皮自荧光SEG扫描和FG激发长波进行。Sytox绿色Alexa Flour 562nm一系列光不扫描距离约1um图像与斐紧ImgeJ的软件（ImageJ的处理，1.44C国立卫生研究院，美国，韦恩Rasband)图像重建和Amira软件。（Mercury计算机系统，TEMS德国柏林）体积测量。2.6 统计分析 在时间依赖性效应实验和运动活性的控制，采用双百方差分析，在获得变量由单向ANOVA或其他Kruska-wallis检查。在剂量依赖实验用案件方差分析表明一个重要结果，事后费舍尔使用的显著性水平为5%3.1进食行为实验3.1.1 时间依赖效应 吸血泵活动时间后，整个记录治疗没有表现出5HT和控制之间任何分歧；直到3:30从40分到3:30后BOT中时间与治疗组（图1A），从控制蚂蚁不停抽水频率不变，到实验（6;30）而5-HT治疗倾向于泵在较低的频率，考虑这些结果，我们分开两个时间5-HT的效果，40mm饥下午3点和3点半之间，6:30后处理（图b）而抽水的频率显著变或周期5-HT 治疗诱发对低频率的趋势与对照相比，基于这些结果，我们分析了喂养的5-羟色胺对行为的影响，在新的实验3:30考虑到蚂蚁大小影响饲料变量，我们用同样大小的蚂蚁，录像显示，虽然饲养时间呈相同两组，保积处理解决方案有5-羟色胺社区的蚂蚁显著降低比摄入控制蚂蚁，这意味着，5-HT治疗蚂蚁提出的控制蚂蚁者如履较低，从理论上讲在一定摄入量下降，下降的部分可能有帝江抽水频率治疗只讲没有显著差异，着一表明，摄入率降低主要有采取每种方案的体积减少决定，有的对于整个摄入量在泵的收缩总量上没有差异。在实验进行了同样的方法，但根据治疗乙型肝炎（每一个日常管理工作，连续6天）控制5-HT溶液，5-HT也显著削弱抽水频率以及每个泵收缩采取的体积，3:30最后的治疗管理3.1.2剂量依赖效应 蚂蚁与不同浓度的5-HT（表1）治疗剂量依赖性修改的摄食行为。3.4.1 在C.mus蚂蚁消化道的整个安装等工作的免疫组织化学分析表明5-羟色胺面也反映过程分布在整个前肠，而在中肠和后肠是完全缺乏5-羟色胺免疫反应过程（图5）。图5B显示了一个有表皮荧光获得的吸泵结构的影像图。5-羟色胺免疫反应过程在头内管道部分和吸泵肌肉是缺乏的。5-HT-IR在咽末端肌肉部分也缺乏，相反，5-HT-IR过程在沿胸部食道，嗉囊。和腺胃都有出现，因此，无论在中肠或后肠（马氏管、小肠、直肠、肛门)都不包含5-HT-IR反应过程。3.4.2 FG和SEG 分析FGs后显示19和28号5-HT-IR细胞体（图6A/6B）,核染色体毫不含糊的允许个别的5-HT-IR细胞组织的鉴定。在每个神经节中，5-HT-IR细胞体在规模大小和染色强度是不同的（图6C）我们测量了在更小细胞内为100um3和最大细胞体内为1900um3，最后得到平均值为720+36um3每个细胞体内。额神经结缔连接FG和大脑，也清楚的表明5-HT-IR纤维（图6A）.SEGs（N=8）包含7对5-HT-IR细胞体（图6D：E），它们被对称地放置在C.mus的神经节两旁。细胞体被分配爱3个群体中（SEG的前部2对，中部3对，后部3对）4.讨论4.1 5-HT 和摄食行为 目前的研究表明5-HT不进了C.mus蚂蚁对花蜜喂养依赖性的降低。饥饿的蚂蚁豆腐5-HT 减少了对蔗糖溶液的摄取量，无论是作为单体治疗或组时由交哺共享。苯胺对摄食行为的一直影响一再其他昆虫被得到证明。当用外源性的5-HT治疗是，食植性的蚜虫饿管芯渗透行为被破坏。像C,mus蚂蚁一糖，蛋白质为饮食基础的昆虫以显示出类似的反应。蟑螂注视5-HT后，奇对蛋白质的摄入偏好增加，同时减少蔗糖的摄入，此外，注视5-HT拮抗剂的若虫过度依赖蔗糖，在果蝇，注射5-HT促进了糖水化合物喂养的减少，以及蛋白质饲料的减少，除了这些结果，我们发现外源性5-HT也影响蚂蚁的吸收动力学和吸泵活性，以剂量依赖方式。此外，我们的记录使我们能够第一时间辨识潜在的机制的影响:5-HT主要通过减少每泵收缩所摄入的液体容量减少摄入率。单剂量的5-HT并没有修改泵的一贯的频率。然而，用5-HT的慢性治疗（连续6天内）促进了这个变量的明确和显著地抑制。3个小时的治疗后，5-HT 治疗组合控制对照组的泵水频率都升高。这可能取决于一天中的某个时间或自上次摄入的时间，与其他昆虫不同的死，C.sum蚂蚁单剂量口服5-HT，它近发挥3:30h作用。在蜂蜜中，在口服后的第一个小时即可测出结果。要求观察效果的时间的差异可能是由于这些昆虫的新陈代谢不同能导致。蜜蜂饲养过程中的代谢率比一个蚂蚁代谢率的125倍还高。吸泵活性的改变并不是由于整个肌肉系统的抑制作用影响。因为一般来说，其活性在5-HT治疗和非5-HT治疗的蚂蚁之间是没有区别的。我们也没有发现任何有口服5-HT引起的改变。虽然口服4h后，5-HT 似乎并没有影响对验收阈值。但是我们并不能排除这种胺对糖感知有一定影响的可能性。以前在其他昆虫进行的研究实验验收味觉神经免疫阈值和灵敏度都与5-HT的等级有关，也可能这种胺在SAT的影响跟随时间进程变化，而不是吸泵活性，然而，沃恩通过这个控制实验，我们的目的是5-HT在记录吸泵活性的时候对SAT 并没有影响，另外，人们可以说，5-HT可能影响蔗糖的反应。在治疗的过程中，摄入蔗糖的一个潜在的影响将隐藏着推动胺改变的可能。如果确实这种情况，者如它经常在昆虫中，包括蚂蚁，5-HT 的注射管理将允许我们检验阈值的改变。关于5-HT在昆虫血淋巴的浓度可谓知之甚少。据报道，在unfed R-P幼虫在开始摄入5min后，从7nm左右上升到了115nm。在欧洲粉蝶，在其发展阶段和光周期内，血淋巴水平相差很大。检测不到的水平介于1.6im的幼虫到化蛹一天后12im。5-HT在鹰蛾幼虫中并未检测到。另一方面，在蜜蜂与其他生物胺的研究表明在口服治疗1h后，约1%的药物摄入总量被发现在腹部淋巴。没有足够的可利用的信息，5-HT是否以类似的方式行事但是我们观察到，7.5mm5-HT溶液的影响。4.2.5 5-HT饱和度 有一些证据表明，5-HT在昆虫的饱和信号中发挥重要作用。在吸血昆虫中，淋巴5-HT水平和5-HT-IR着色，在不同领域的改变和采食事件有关。以同样的方式，喂养以糖和蛋白质为基础的果蝇后，作为喂养的结果，暗示着苯胺的一种释放，5-HT-IR细胞神经节着色减少。在目前的工作，单剂量的5-HT降低了摄入率，因为碳水化合物饱和，然而面对5-HT影响，引起每泵收缩摄入的溶液体积，采食状态造成泵频率的改变。当每收缩体积保持不变时，值得指出的是在连续 6天的日常治疗中，观察到抽水频率的改变。4.3.5 5-HT与消化道的关系在不同的昆虫中，沿食道的神经节进程中存在5-HT是一致的，而苯胺在消化道的分布差别很大，在蝗虫和蟋蟀体内，5-HT来自前肠和后场的咽后壁而不是在食窦和前咽。相反，P.美洲肠缺乏这种生物胺，在目前的研究中，5-HT-IRZAI C.mus蚂蚁的过程在食窦和咽部包括吸泵肌肉是缺乏的但5-HT-IR进程与共享的前胸食道，嗉囊，腺胃是明显有关联的。昆虫间这些不同可能反映5-HT在饲喂活动中，控制特定细胞体的角色。他们也可能与不同物种的营养需求相关。在群居蚂蚁（如:camponotus蚂蚁花蜜喂养）的专门研究中，腺胃的控制在个体与社会粮食分配的平衡中是一个关键的因素。Cauponotus蚂蚁的腺胃高度发达，并调节社会胃之间的流量，因为它的内容可以是作为共享反流给其他同伴，长消化的食物是个别供应。此外，碳水化合物饥饿强烈影响血淋巴的血糖水平。另一方面，在蜜蜂，碳水化合物水平是负责通过腺胃控制糖的运输率。5-HT-IR在 C.mus蚂蚁嗉囊，腺胃饿存在表明苯胺可能参与了该过程的调控。4.5 喂养规则的可能机制 众所周知，在昆虫，5-HT作用于内脏肌肉的收缩，一些研究已表现出兴奋作用，而其他表现出松弛作用。在我们饿研究结果中，吸泵肌肉紧张性的减退可能是5-HT管理。造成的课解释为什么每泵收缩摄入溶液体的减少。如果这样的话，吸泵肌肉的这种行为死特殊的。因为一般运动活性不是由5-HT管理所改变的，在淋巴外源性的5-HT可能采取行动，通过到达中央神经系统目标，或直接参与喂养的肌肉。小分子的生物胺能够从肠道淋巴，大脑，和神经组织，因为正如它表现在蜜蜂的章鱼胺中。由5-HT-IR进程均在肌肉吸泵本身发现，我们排除5-HT直接从神经节支配这种结构，据悉，5-HT与多巴胺和章鱼胺在神经节整合和代谢，此外，在所有来自消化道的神经节内的材料可以到达并调节肌肉。生物胺可能对前后运动神经元突触有一定影响。通过改变突触效力肌肉性能。即使没有疏导这些物质的直接神经供应，它们可能受到淋巴的影响，此外，下C.mus蚂蚁的FG的大量5-HT-IR实验，表明5-HT可能间接影响吸泵活性。然而，虽然一些机制已经被提出，5-HT的促进它在摄食调节方面的确切路径，还没有完全被理解。有一些证据显示，蝗虫的前肠活动可能通过体液调节的释放调节FG作为才使得结果。此外，蟋蟀的前肠运动表明存在食物介导的神经体液因素。在一些昆虫喂养后，以证明5-HT释放入淋巴中，这种胺可能是体液因子的重要组成部分。无论是通过消化道到达FG或外周。另外，某种前场后部的反馈虽然受血清素程序的支配，受吸泵收缩的影响。消化道肌肉的这种调节机制先前已在蟋蟀提出，隔离前肠增加其自发活性同时保持与中肠和后肠的接连，支持这样一个反馈机制。 总之，我们表明5-HT1：调节蚂蚁的饲喂过程2：在吸泵的活性中扮演一个重要的角色3:在调节社会和个人食品消耗的平衡结构和控制摄食的神经中枢虽然存在。糖饥饿和内源性5-HT水平之间关系的新见解会导致我们对饱食，喂养动物和饲养昆虫的控制有一个更好的了解。致谢 我们感谢两名匿名人员的宝贵意见，以提高改善手稿。引用文献：Ali, D.W., 1997. 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