生物工程实验讲义.doc

天然产物分离与纯化实验指导（生命科学系内部资料）天然产物分离与纯化实验指导实验须知天然产物分离与纯化实验教学是天然产物分离与纯化技术课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然产物有效成分提取、分离和检定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力。养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。为此，提出下列实验须知：1遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。2实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天计划，争取准时结束。实验过程应养成及时记录的习惯。凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录，实验完毕后，认真总结，写好报告，提取纯化所得产物包好，贴上标签（日期、样品名称、纯度、TLC、重量）交给老师。3实验室中保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟、不迟到、不随便离开，实验台面应保持清洁，使用过的仪器及时清洗干净，存放在实验柜内，废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。4公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。节约用水、用电、药用试剂。严格药品用量。5保持实验室内整洁，学生采取轮流值日，每次实验完毕，负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，检查水、电和门窗是否关闭。前 言天然产物分离与纯化是运用现代科学理论与方法研究天然产物中生物活性成分的一门学科。其主要内容是研究各类天然有机化合物（主要是植物）的化学成分(主要是生物活性成分或药效成分)的结构特征、理化性质、提取、分离、检识以及主要类型化学成分的结构鉴定知识等。此外，还将涉及中草药制剂的成分分析等内容。 本课程设置了提取分离、鉴定技术的大量实验操作内容，以期通过对知识的学习与操作练习，使同学们充分了解技术原理并熟练掌握天然产物中有效成分的提取、分离与鉴定的常用方法。设置的相应方法有：溶剂提取法(对比了浸渍法、回流提取和连续回流提取法)；层析法(设置了薄层层析、柱层析、HPLC法的组合对比实验)；物质鉴定方法(对比了化学法、色谱法和光谱法)；含量测定(设置了分光光度法与HPLC法)。 同时，针对高年级同学已系统学习过有机化学、分析化学、物理化学和生物化学等课程，为进一步培养和锻炼同学们运用理论知识、独立操作、分析思考和解决问题的能力，本课程将实验内容中提取、纯化部分设置为需自行摸索最适条件的探讨型试验，这是和以往实验教材最大的不同之处，目的是使同学们在开放的实验环境下，充分发挥主观能动性，摸索试验条件，解决具体问题，培养应用基本理论去分析和解决实际问题的能力。我们希望通过这些实验和探索，让同学们获得天然产物分离与纯化最基本的实验技术训练，为今后独立科研和工作打下扎实的基础。1.相关基础知识 1.1 有效成分提取常见方法 有效成分提取常见方法：溶剂法，水蒸气蒸馏法1.1.1溶剂提取法 (1)浸渍法：将处理过的药材，用适当的溶剂在常温或温热(6080)的情况下浸渍以溶出其中成分。本法适用于有效成分遇热易破坏以及含多量淀粉、树胶、果胶、粘液质的药的提取。但浸出效率差。 (2)渗漉法：向粗药粉中，不断添加浸出溶剂使其渗过药粉，从渗漉筒下端出口流出浸出液的方法。溶剂消耗量大、费时长。 (3)煎煮法：加水加热煮沸。但含挥发性成分、有效成分遇热易破坏的药材不易用此法。 (4)回流提取法：如用易挥发的有机溶剂加热提取植物材料时，需采用此法。遇热易破坏的成分不易用此法，且溶剂消耗大、操作较烦。 (5)连续提取法：为弥补回流提取法中需要溶剂量大，操作较烦的不足，可采用连续提取法，采用索氏抽提器，遇热易破坏的成分不易用此法。1.1.2 水蒸气蒸馏法 适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分的沸点多在100度以上，并在100度左右有一定的蒸气压。挥发油、某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱、某些小分子酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏。 水蒸气蒸馏装置1.1.3其它提取方法 除以上方法外，提取的方法还有升华法、超临界流体萃取法、超声波法和微波萃取法等。 升华法：某些固体物质如水杨酸、苯甲酸、樟脑等受热在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结为固体。但药材中的物质可升华的很少。 超临界流体萃取法：当一种物质处于其临界温度与临界压力以上的状态下，形成既非液体又非气体的单一相态，称为超临界流体(supercrictical fluid)。密度近似液体，粘度有气体数倍，扩散力比液体大增，介电常数也随压力的增大而增加，其浸透性优于液体，有更佳的溶解性，有利于溶质的萃取。利用一种物质在超临界区域形成的流体进行提取的方法，称为“超临界流体萃取法”。常用超临界流体有二氧化碳、氧化亚氮、乙烷、乙烯等，最常用二氧化碳。 超声波提取技术是利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，加速药物有效成分进入溶剂，从而提高了提出率，缩短了提取时间，并且免去了高温对提取成分的影响。 微波法：微波是一种波长在l0.001m、频率在300MHz300GHz的电磁波。由于其具有独特的性质似光特性、穿透特性、热特性、生物效应，因而已被广泛应用于医药领域。 在中草药有效成分的提取中亦有尝试和应用，但尚未在规模生产中应用。微波提取技术主要是基于微波的热特性，其加热原理是利用微波场中介质的偶极子转向极化与界面极化的时间与微波频率吻合的特点，促使介质转动能级跃迁，加剧热运动，将电能转化为热能。微波辐射导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能量而产生大量的热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞壁和细胞膜冲破，形成微小的孔洞。进一步加热，细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂隙。因此使胞外溶剂容易进入胞内，溶解并释放出有效成分。1.2有效成分的分离与精制 植物材料经上述方法(溶剂法等)提取后，提取液是混合物，需进一步分离纯化，可根据混合物中各物质溶解度差别、在两相溶剂中的分配比不同、各物质的吸附性差别、分子的大小差别和物质解离程度不同进行分离。1.2.1根据物质溶解度差别进行分离(1)利用温度不同引起溶解度的改变以分离物质，如常见的结晶及重结晶等操作。(2)在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。(3)对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸、碱以调节溶液的pH值，改变分子的存在状态(游离型或解离型)，从而改变溶解度而实现分离。如：一些生物碱类在用酸性水从药材中提取出后，加碱调至碱性即可从水中沉淀析出、调节pH至等电点使蛋白质沉淀的方法。(4)酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出。如酸性化合物可做成钙盐、钡盐、铅盐等；碱性化合物如生物碱等，则可做成苦味酸盐、苦酮酸盐等。1.2.2根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离(1)液-液萃取法：利用两种物质在不相混溶的两相间分配系数不同(2)逆流分溶法(countercurrent distribution CCD)：是一种多次、连续的液-液萃取分离过程。(3)液-液分配柱色谱法：将两相溶剂中的一相涂覆在载体上，作为固定相，填充在层析管中，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂(流动相)冲洗层析柱，这样，物质在两相溶剂相对作逆流移动过程中不断进行动态分配而得以分离。分配柱色谱用的载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉。1.2.3根据物质的吸附性差别进行分离该方法利用吸附剂(固定相)对混合物中各成分吸附能力的差别而达到分离目的的。一般有薄层色谱与柱色谱两种方式，常用吸附柱色谱进行分离。 常见吸附剂可分为：极性吸附剂：硅胶、氧化铝(用极性溶剂解吸附) 非极性吸附剂：活性炭(用非极性溶剂解吸附) 氢键吸附剂：聚酰胺 大孔吸附树脂：一种常用的吸附剂。它是一种不含离子交换基团，具有大孔网状结构的高分子材料。利用本身的吸附性和筛选性使各成分获得分离。吸附性是由于范德华力和氢键的结果，筛选性是由于其本身多孔性结构决定的。 常见溶剂极性(依次递减)：水甲醇乙醇乙酸乙酯氯仿乙醚苯乙烷石油醚1.2.4根据分子的大小差别进行分离 植物成分分子大小各异，分子量从几十到几百万，故也可据此进行分离。常有透析法、凝胶过滤法、超滤法，超速离心法等。常用凝胶柱层析法将大小不同的混合物分离，常见的凝胶有：葡聚糖凝胶(Sephadex)、羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20，可采用有机溶剂洗脱)、丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel A)和琼脂糖凝胶(Sephadex)。1.2.5根据物质解离程度不同进行分离 植物成分中，具有酸性、碱性及两性基团的分子，在水中多呈解离状态，据此可用离子交换法或电泳技术进行分离。2.实验目的和要求(1) 通过提取分离、鉴定技术原理学习与操作练习，充分了解技术原理并熟练掌握相关技术方法。(2) 本课程设置了同一内容的组合及对比实验，以及最佳提取纯化条件的探讨试验，注重独立操作、分析思考和解决问题能力的培养。 (3) 实验设计中要求包含提取和纯化最佳条件的摸索过程。(4) 按自行设计的方案进行实验，要求有完整的提取分离、鉴定的过程，并获得提取物。(5) 实验中应如实记录原始数据和实验现象，并严格遵守实验规则。(6) 实验完成后，按标准论文格式写出完整规范的报告，实验报告格式：包括标题、实验目的、实验原理、材料、方法、结果、讨论和参考文献。实验一 果胶的提取和果冻的制备 果胶广泛存在于水果和蔬菜中，主要存在于细胞壁间隙中，把纤维素、半纤维素结合在一起，成为细胞壁的组成成份。如苹果中含量为0.71.5%(湿品计)，在蔬菜中以南瓜含量最多，是717。【实验目的】 掌握植物中果胶物质的提取方法以及了解果冻的制备。【实验原理】果胶基本结构是以a-1，4糖苷键连结的半乳糖醛酸，其中部分羧基被甲酯化，其余的羧基与钾、钠、铵离子结合成盐。一、实验材料和试剂 桔皮(新鲜) 0.25%HCl，95%乙醇，蔗糖、柠檬二、实验步骤1.果胶的提取 (1) 原料预处理：称取新鲜柑桔皮40g(干晶为8g)用清水洗净以后，放入500ml烧杯中加120ml水，加热至90保持10min，使酶失活。用水冲洗后切成35mm大小的颗粒，用50左右的热水漂洗，直至水为无色、果皮无异味为止。每次漂洗必须把果皮用尼龙布挤干，再进行下一次漂洗。 (2) 酸水解萃取：将预处理过的果皮粒放入烧杯中，加约0.25%HCl 120ml，以浸没果皮为度，pH值调整在2.02.5之间，加热至90，煮45分钟，趁热用尼龙布(100目)或四层纱布过滤。 (3) 脱色：在滤液中加入0.5%的活性炭于80加热20min进行脱色和除异味，趁热抽滤，如抽滤困难可加入24%的硅藻土作助滤剂。如柑桔皮漂洗干净，萃取液为清彻透明，则不用脱色。 (4) 沉淀：待萃取液冷却后，用稀氨水调节至pH为34，在不断搅拌下加入95% 乙醇，加入乙醇的量约为原体积的1.3倍，使酒精浓度达50%60%可用酒精汁测定，静置10分钟。 (5) 过滤、洗涤、烘干：用尼龙不过滤，果胶用95%乙醇洗涤二次，在6070烘干。2. 柠檬味果冻的制备(1)将果胶0.2g（干品）浸泡在20ml水中，软化后在搅拌下慢慢加热至果胶全部溶化。(2)加入柠檬酸0.1g，柠檬酸钠0.1g和蔗糖20g，在搅拌下加热至沸，继续熬煮5分钟，冷却后即成果冻。实验二、茶叶中咖啡因的提取、鉴别茶叶为山茶科植物茶等植物的干燥叶枝，有提神、利尿等功效。其所含化学成分有生物碱、黄酮类、维生素、麦角甾醇、挥发油等。其中生物碱咖啡因对中枢神经系统有广泛的兴奋作用，对某些肿瘤有抑制作用，还有抗病毒活性。 咖啡因 L-EGF（1,3,7-三甲基-2,6-二氧嘌呤） L-EGCG L-GCG茶多酚为白色无定形粉末，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿。茶多酚在茶叶中的含量一般为1528，是含量较多的一类有机混合物。它们属于黄烷醇类，目前发现有十多种。其中主要有：L-EGGG:L-(-)表没食子儿茶素没食子酸酯；L-EGF:L-(-)表没食子儿茶素；D,L-GC:D,L-没食子儿茶素；L-GCG:L-(-)没食子儿茶素没食子酸酯等；它们都是苯并吡喃和没食子酸结合的衍生物。由于它们分子中都具多个酚羟基，因此儿茶素又称茶多酚，结构如上；茶多酚是天然抗氧化剂，具有很强的清除自由基作用，具有抑制突变、癌变、脂质过氧化、抗衰老、抗辐射等多种生理作用。一、实验目的：学习和掌握提取精制咖啡因和茶多酚的操作方法。掌握生物碱的一般提取方法。二、实验原理：咖啡因是弱碱性化合物，化学名称为1,3,7-三甲基-2,6-二氧嘌呤，分子式为C8H10N4O2，化学结构如后。含结晶水的咖啡因是无色针状结晶，味苦，易溶于氯仿、二氯甲烷，可溶于水、丙酮和乙醇等溶剂中。在100时失去结晶水，并开始升华，升温到120178时迅速升华。无水咖啡因的熔点为235-237。三、实验材料和试剂仪器： 索氏提取器 滤纸筒 圆底烧瓶球形冷凝管 蒸发皿 玻璃漏斗 布氏漏斗吸滤瓶 分液漏斗 热浴试剂： 茶叶 生石灰 粉状碳酸钙 95乙醇（工业级）二氯甲烷 丙酮 石油醚（60-90）四、实验步骤1.粗咖啡因的提取方法一 称取10g碎茶叶和10g碳酸钙粉末，一并装入250mL圆底烧瓶中，再加入150mL热水（5060），安装回流装置，加热回流提取约30min，回流结束后，趁热抽滤,即得提取液。在冷水浴中将其冷至室温后即转入分液漏斗中，用25mL二氯甲烷萃取23次，萃取液合并后用普通蒸馏法回收二氯甲烷至干，残留物即为咖啡因粗品，称重，并计算干茶叶中粗咖啡因的百分含量。方法二 称取10g碎茶叶末，装入250mL圆底烧瓶中，再加入150mL热水（5060），安装回流装置，加热回流提取约30min，回流结束后，趁热抽滤,即得提取液。在冷水浴中将其冷至室温后即转入分液漏斗中，用25mL二氯甲烷萃取23次，萃取液合并后用普通蒸馏法回收二氯甲烷至干，残留物即为咖啡因粗品，称重，并计算干茶叶中粗咖啡因的百分含量。方法三 称取10g碎茶叶放入索氏提取器的滤纸套筒中在圆底烧瓶中，加入200mL95乙醇,水浴加热，连续提取约2h，至虹吸液颜色较淡为止。待提取器内提取液刚刚虹吸下去时，停止加热，稍冷却后改用普通蒸馏装置，蒸去大部分乙醇。余液趁热倾入蒸发皿中，并拌入34g生石灰调制至糊状，在不断搅拌下于蒸气浴上蒸干，并压碎块状物呈粉末状。即得含有大量杂质的粗产物，待升华分离纯化。2.咖啡因的分离和纯化方法一 将咖啡因粗品溶于少量丙酮（约5mL）中，慢慢滴加石油醚（6090）至溶液有淡淡的混浊为止。冷置结晶，用玻璃漏斗抽滤收集产物。干燥后称重,并计算收率。方法二 将盛有咖啡因粗提物的蒸发皿置于石棉网上，用小火焙烧片刻，以除去全部水分。擦去蒸发皿边沿的粉末，盖上一张刺有多孔且孔刺向上的圆形滤纸，上罩一个口径合适的长颈玻璃漏斗，用砂浴小心升温至180220即有升华物。当滤纸上出现许多白色毛状物结晶时，停止加热，稍冷后小心取下漏斗，揭开滤纸，用刮刀刮下纸上及器皿周围的咖啡因。残渣经拌合后用较大的火继续加热升华，使升华完全。合并两次收集的咖啡因，称重并计算收率。3.咖啡因性质试验碱性试验 取少量的咖啡因与试管中，加1mL水使成溶液，用红石蕊纸或pH试纸测试，观察并记录现象。氧化试验 取上述试管中咖啡因溶液3滴于另一试管中，加l滴0.5KMnO4和1滴5NaCO3溶液，摇动试管(必要时用沸水浴加热)，观察有何变化，并解释。成盐试验 取上述试管中咖啡因溶液3滴于另一试管中，加入1mL饱和苦酮酸或苦味酸溶液，摇匀后观察现象。亚硝酸钠试验 在试管中加入5滴上述咖啡因水溶液，加3滴浓盐酸和少许冰渣，在冰水浴中保持05，振荡下慢慢滴入3NaNO2溶液约10滴，观察现象，并记录。实验三、甘草酸的提取、鉴定中药甘草，属豆科植物，生长于草原向阳干燥钙质土地以及河岸沙质地土壤中，富含甘草皂苷，又称甘草酸，特点是高甜度、低热能、安全无毒，起泡性和溶血作用很低。具有增溶、增加药物稳定性、提高生物利用度及降低毒副作用的功效。甘草酸的许多金属盐，人体可适当吸收，不易造成元素的积蓄中毒。因此常被用来配制成健脾开胃、止咳化痰、顺气止喘、治疗慢性肝炎、降低血脂的良药。同时还具有抗癌防癌、干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂等功能。一、实验材料和试剂 甘草，去离子水，硫酸二、实验步骤1. 市售甘草干燥，用粉碎机将其粉碎成粉末。2. 称取一定量的甘草粉末，加入规定剂量的去离子水，控制温度70，固液比1：8，提取时间2小时。提取次数2次。3. 提取液过滤，浓缩，滴加3.5mol/l的硫酸至pH23，静置使之完全沉淀，离心，沉淀用去离子水洗23次，放入真空干燥箱中干燥，得甘草酸粗品。 4. 甘草中甘草酸的测定：提取液摇匀，准确移取一定量的提取液转移到25ml容量瓶中，用70%乙醇定容，静置20min后，于254nm处测定吸光度。据标准曲线计算提取液中甘草酸的浓度，再计算甘草酸提取率。公式如下：A=13.17C0.017 （参考）式中：A-吸光度； C-浓度，mg/ml甘草酸提取率= nCV/m100%其中：n-提取液稀释倍数 C-提取液中甘草酸的浓度mg/ml V-提取液体积，ml m-甘草的质量，mg实验四、碱溶酸沉淀法提取黄酮槐花米系豆科槐属植物槐树（Sophora japonica L）的花蕾，未开时采收花蕾，商品称“槐米”。槐米中芸香甙含量多，开放后含量少：除此外还有O.4的三萜皂甙，水解后得白桦脂醇、槐花二醇和葡萄糖、葡萄糖醛酸；槐米中还含有槐花米甲素(14)、乙素(1-25)和丙素(O.35)，甲素是和芸香甙不同的黄酮类，乙素和丙素为甾醇，还含有鞣质，芸香甙(Rutin)结构如下： 芸香甙属黄酮中黄酮醇类化合物在临床上主要用于糖尿病、高血压的辅助治疗。可利尿镇咳，降血脂，降压，保护溃疡面，抗炎和抗过敏作用。具有降低毛细血管通透性、抗炎、抗病毒、镇痛、抗氧化及抑制醛糖还原酶等多方面药理活性。 国内外医药工业中用芦丁作原料生产多维葡萄糖羟乙基芦丁、槲皮素、二乙胺基甲基芦丁、二乙胺基乙基芦丁、芦丁镁络盐、羟乙基槲皮素、烟酸镁芦丁络盐、对氯苯氧异丁酸镁芦丁络盐及维脑路通等心血管药物。已知重要成分性质：1 芦丁（芸香苷，rutin）淡黄色针晶，水中结晶者含3分结晶水，C27H30O163H2O 100mmHg和110加热12小时后，变为无水物，无水物于25变棕，1157软化，2145发泡分解，1g芦丁溶于约300ml冷水，200ml沸水，7ml沸甲醇，溶吡啶，甲酰胺和碱液，微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，二硫化碳、乙醚、苯和石油醚。2 槲皮素（Guereetin）为芦丁的苷元，C15H10O7，MW302.23；含二分子结晶水为黄色针晶，（稀乙醇），57失水，314溶解，1g溶于290ml无水乙醇、23ml沸乙醇，溶于冰醋酸，一般在碱水中溶解显黄色，几乎不溶于水。3 皂苷（Saponin）粗品为白色粉末，mp 21020（dec）。易溶于吡啶。能溶于200倍的甲醇，酸水解得下列两种苷元及糖。糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄醛酸内酯。（1）白桦酯醇（Betulin）无色针晶，mp2152，能溶于醋酸，丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等；难溶于石油醚和水。槐花二醇（Sophoradiol）无色针晶，mp21920或224，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇、难溶于水。【实验目的】 1碱溶酸沉法从槐花中提取黄酮粗品。 2重结晶法精制黄酮。【实验原理】利用黄酮类化合物分子多数具有酚羟基，显弱酸性，可溶于碱液中，而难溶于酸水的性质，用碱水提取，在碱水提取液中加酸酸化，黄酮类化合物即可沉淀析出，并利用被提取物对冷水和热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。【器材与试剂】1. 实验仪器：电子天平，真空泵、布氏漏斗、pH试纸、纱布、烧杯、量筒、烘箱2. 实验试剂：0.4%硼砂（四硼酸钠）水溶液、石灰乳、盐酸3. 实验材料：槐米【实验步骤】提取分离和纯化注1：硼砂因能与芦丁结合，起保护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用，实验证明，提取时加入硼砂，产品质量要好些。注2：加石灰乳既能达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐花米中大量的粘液质和酸性树脂（形成钙盐沉淀），但pH不能过高和长时间煮沸，因为会导致芦丁的降解。注3：pH过低会使芦丁形成锌盐而降低收率。2. 绘制标准曲线：分别取芦丁母液0，1，2，3，4，5，6 ml于25ml容量瓶，依次加入10，9，8，7，6，5，4 ml 70乙醇，混匀，使溶液体积为10 ml，于各容量瓶中加l ml 5NaN02，混匀；6 min后加入1 ml 10Al(N03)3，混匀，放置6 min，再加入10 ml 4NaOH，用70乙醇定容至刻度，混匀，15-20 min后以0管作为空白，于510nm处测吸光度OD值。以OD值为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制浓度OD值标准曲线。4. 样品测定：样品取1 ml，加入9 ml 70乙醇，其他同上操作，每个样品设置3个平行管。按上述方法测定OD值，从标准曲线查得样品中总黄酮的含量，然后根据下式计算每克干槐米中黄酮的含量： 干槐米中总黄酮的含量(ug/g)=VCV为lg槐米制得的提取液体积ml即(1/干重含量)100，C为提取液中测得的总黄酮含量，ugml。【注意事项】 1槐花中含有大量粘液质，加入石灰乳使其生成钙盐沉淀除去。 2硼砂的作用是保护黄酮的母核不被破坏。 3pH应严格控制在一定范围，否则会引起结构的破坏或变化。参考文献 张继杰主编天然药物化学北京：人民卫生出版社，1999，6263实验五、黄芪多糖的提取、测定（自行设定）黄芪为豆科植物，是一种常用扶正中药，性味苦，微温，古书记载“可治一切气衰血虚之症”，具有补气固表的功能。而黄芪多糖能使动物脾脏增大，脾内浆细胞增生，促进抗体合成。且能对抗强的松等免疫抑制剂的影响，对抗体免疫功能亦有促进作用。一、实验材料和试剂 黄芪，95%乙醇，葡萄糖标准品，苯酚，浓硫酸二、实验步骤 1. 取黄芪粉末80g，水煎煮两次，第一次10倍水2小时，第二次8倍水1小时。合