第5章 生物相容性及评价 第2节.docx

第5章：生物相容性及评价Part B内 容5B.1 概述-生物相容性的评价与标准、医疗器械分类、评价试验指南、流程、基本原则5B.2 体外评价-细胞毒性5B.3 体内评价-体内组织相容性试验、动物模型选择15B.1 概述生物相容性的评价与标准、医疗器械分类、评价试验指南、流程、基本原则与人体接触的生物材料产品研发的全过程2Timeline for new biomaterials/device introduction(Investigational Device Exemption)美国试验用医疗器械的豁免制度3l 生物材料的生物相容性（安全性）及在体内使用功能（有效性）如何是生物材料获得实际应用前必须解决的问题 测试和评价l 途径：体外试验和体内试验l 体外条件下的评价能够提供快速又经济的生物学相互作用数据，帮助判断一种生物材料是否需要体内实验模型来做进一步的评价。但体外试验获得的参数与在复杂的体内环境下获得的结果不一定有关联性。l 动物体内试验可以模拟人体环境对受试材料的反应，但不同动物的解剖、生理和生化特点相差甚远。 动物实验设计应尽可能选择一个在解剖学和生化上类似于人体的动物模型l 由于生命系统的高度复杂性，生物学实验数据具有相当的不稳定性，为了从昂贵的试验中得到可靠的结论，统计分析是确保一定范围内的测试结果有意义的必要工具，另外l 测试和评价方案可借助于（国内或国际的）标准进行：生物材料生物学评价标准从20世纪70年代后期开展研究以来，经过30多年国际间协同研究，已形成了从细胞水平到整体动物的较完善的评价框架。国际标准化组织（ISO）以10993编号发布了20个相关标准，用于生物相容性评价。l 各类生物学评价标准都是建立在已有的对生物相容性研究的基础上，是为保证产品的质量和临床使用的安全性而建立的。ISO 10993 Biological evaluation of medical devices由ISO/TC 194 国际标准化组织医疗器械生物学评价技术委员会制定The ISO 10993 set entails a series of standards for evaluating thebiocompatibility of a medical device prior to a clinical study.l Part 1: Evaluation and testing in the risk management processl Part 2: Animal welfare requirementsl Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicityl Part 4: Selection of tests for interactions with bloodl Part 5: Tests for in vitro cytotoxicityl Part 6: Tests for local effects after implantationl Part 7: Ethylene oxide sterilization residualsl Part 8: Selection of reference materialsl Part 9: Framework for identification and quantification of potentialdegradation productsl Part 10: Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity4l Part 11: Tests for systemic toxicityl Part 12: Sample preparation and reference materials (available inEnglish only)l Part 13: Identification and quantification of degradation productsfrom polymeric medical devicesl Part 14: Identification and quantification of degradation productsfrom ceramicsl Part 15: Identification and quantification of degradation productsfrom metals and alloysl Part 16: Toxicokinetic study design for degradation products andleachablesl Part 17: Establishment of allowable limits for leachable substancesl Part 18: Chemical characterization of materialsl Part 19: Physico-chemical, morphological and topographicalcharacterization of materialsl Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing ofmedical devices国标GB/T 16886 医疗器械生物学评价基本上是等同采用国际标准ISO 10993系列l GB/T 16886.1 - 2001l GB/T 16886.2 - 2000l GB/T 16886.3 - 2008l GB/T 16886.4 - 2003l GB/T 16886.5 - 2003l GB/T 16886.6 - 1997l GB/T 16886.7 - 2001l GB/T 16886.9 - 2001l GB/T 16886.10 - 2005评价与试验动物保护要求遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验与血液相互作用试验选择细胞毒性试验：体外法植入后局部反应试验环氧乙烷灭菌残留量潜在降解产物定性与定量框架刺激与迟发型超敏反应试验5l GB/T 16886.11 1997 全身毒性试验l GB/T 16886.12 2005 样品制备与参照样品l GB/T 16886.13 2001 聚合物医疗器械的降解产物定性与定量l GB/T 16886.14 2003 陶瓷降解产物的定性与定量l GB/T 16886.15 2003 金属与合金降解产物的定性与定量l GB/T 16886.16 2003 降解产物与可沥滤物毒性动力学研究设计l GB/T 16886.17 2005 可沥滤物允许限量的建立l ISO 10993-18:2005 材料的化学表征l ISO 10993-19:2006 物理化学、形态学和表面特性表征l ISO 10993-20:2006 医疗器械免疫毒性试验原理和方法l 医疗器械(medical device)：是指单独或者组合使用于人体的仪器、设备、器具、材料或者其他物品，包括所需要的软件；其用于人体体表及体内的作用不是用药理学、免疫学或者代谢的手段获得，但是可能有这些手段参与并起一定的辅助作用；其使用旨在达到下列预期目的：（一）对疾病的预防、诊断、治疗、监护、缓解；（二）对损伤或者残疾的诊断、治疗、监护、缓解、补偿；（三）对解剖或者生理过程的研究、替代、调节；（四）妊娠控制。医疗器械临床医疗(敷料、导管、注射器、内植物等)日常生活(创口贴、体温计、接触镜等)整形美容(隆鼻、隆胸等)6Medical Device Categorization by TissueContact 组织接Contact接Duration）按与组织接触部位-表面接触器械-外部接入器械-植入器械皮肤：仅接触未受损皮肤表面的器械黏膜：与粘膜接触的器械损伤表面：与伤口或其它损伤体表接触的器械血路(间接)：侵入血管与血路上某一点接触；作为管路向血管系统输入的器械组织/骨/牙质：侵入组织、骨和牙髓/牙质系统的器械和材料血液循环：接触血液循环系统的器械包括植入用于与组织/骨、血液接触的器械按接触时间-短期(A)：一次或多次使用接触时间在24小时以内-长期(B)：一次、多次或长期使用接触时间在24小时以上30日以内-持久(C)：一次、多次或长期使用接触时间超过30日*Derived from standards, protocols and guidelines utilized in the past for safetyevaluation of medical devices.表面接触生物材料/医疗器械分类7医疗器械的分类（分别按照与and 触的部位和 触时间分类外部接入生物材料/医疗器械分类体内植入生物材料/医疗器械8美国食品药品监督管理局为直属美国健康及人类服务部管辖的联邦政府机构，其主要职能为负责对美国国内生产及进口的食品、膳食补充剂、药品、疫苗、生物医药制剂、血液制剂、医学设备、放射性设备、兽药和化妆品进行监督管理，同时也负责执行公共健康法案的第361号条款，包括公共卫生条件及州际旅行和运输的检查、对于诸多产品中可能存在的疾病的控制等等。l按使用的安全性/风险高低分类：ClassIIIIIIRiskLowMediumH第一类 ( I 类 )是指风险小或无风险的产品，通过常规管理足以保证其安全性、有效性的医疗器械。Class InPresent minimal potential for harm to theuser产品只需进行注册、列名和实施GMP规范n Subject to “General Controls” (GoodManufacturing Practices, Labeling)n 40% of all devices are Class I良好作业规范: 是一种特别注重在生产过程中实施对产品质量与卫生安全的自主性管理制度n Examples: elastic bandages, hand-heldsurgical tools9第二类 ( II 类 )是指对其安全性、有效性应当加以控制的医疗器械。Class IIn“General Controls” alone are insufficient toprovide assurance of safety and efficacy要求进行上市前通告510(k)nnnSubject to “Special Controls” (Mandatoryperformance standards, post-marketsurveillance)50% of all devices are Class IIExamples: contact lens case, hospital bed,510(k)文件是向FDA递交的上市前申请文件，申请者必须把申请上市的器械与现在美国市场上一种或多种相似器械对比，得出并且支持等价器械的结论，即为“等价器械” （我也是）。prosthetic elbow在美国上市的医疗器械，制造商必须经过两个评估过程其中之一：上市前通知书510(k)（如果没有被510(k)赦免），或者上市前批准(PMA)。第三类 ( III 类 )是指植入人体；用于支持、维持生命；对人体具有较高风险或危险，对其安全性、有效性必须严格控制的医疗器械。Class IIInDevices that are life-sustaining or have thepotential for leading to illness or injury上市前批准(PMA)n Subject to pre-market approvaln 10% of all devices are Class IIIn Examples: coronary stents, breast审查该申请的医疗产品，是否具有足够有效的科学证据以确保该产品的安全性和有效性。implants, IUD10/gyx02302/flml.htm医用卫生材料及敷料11医用缝合材料及粘合剂12植入材料和人工器官医用高分子材料及制品13l 医疗器械生物学基本评价试验指南GB/T16886.1ISO 10993.1(2003)器械分类生物学试验人体接触接触时间A：短期(24h)B：长期(24h-30d)C：持久（30d）细胞毒性致敏刺激或皮内反应全身毒性（急性）亚慢性（亚急性）毒性遗传毒性植入血液相容性表面皮肤ABC器械黏膜ABCA损伤表面BCA外血路、间接B部接C入器械植入器械组织/骨/牙接入循环血液组织/骨血 液ABCABCABCABCl 医疗器械生物学补充评价试验指南器械分类生物学试验表面器械人体接触皮肤黏膜接触时间A：短期(24h)B：长期(24h-30d)C：持久（30d）ABCABC慢性毒性致癌性生殖与发育毒性生物降解A损伤表面BCA外血路、间接B部接入器组织/骨/牙接入CABC械A循环血液BC植入组织/骨ABC器械血液ABC14l 医疗器械生物学评价流程5,61)医疗器械生物学评价的基本原则：l 参照GB/T 16886.1-2001评价试验指南要求选择试验项目l 生物学试验应先体外再体内l 符合GLP专业实验室和专业技术人员l 评价结论强调综合分析155B.2 体外评价（细胞毒性）生物材料/医疗器械的消毒l 蒸汽消毒 将待消毒材料/器械置入121C高压蒸汽中处理，使微生物存活所需要的蛋白质和脂质变性 优点：高效、快速、简单，样品中不留毒性残留物 不足：不适宜于低熔点材料的消毒、也不适合于对可水解性聚合物的消毒l 环氧乙烷消毒 将待消毒材料/器械置于环氧乙烷（混合有惰性气体）气体中，通过与病原体核酸(DNA，RNA)进行持久的化学置换来消毒 优点：有效，能够深入到材料的缝隙和空腔中去，低温进行，广泛用于各种材料的消毒 不足：环氧乙烷的残留；气体具有反应能力和可致癌性，注意防护l 辐射消毒 用伽马射线或电子束的能量辐射进行消毒 优点：快速、有效，对许多物质都相容 不足：仅适用于薄的器件的消毒，可引起聚合物材料的辐射降解16一些背景概念：l 毒性（Toxicity）- 材料释放大量的化学物质，通过阻止主要的新陈代谢路径而直接或间接杀死细胞。受影响细胞的数量作为化学物质的剂量和效能的评价指标。l 传递与接触剂量 （Delivered and Exposure Doses）- 传递剂量是指被细胞实际吸收的剂量；接触剂量是在整个测试系统中所含的剂量大小。测试中对毒性最敏感的细胞即目标细胞被用来评价细胞的毒性。-细胞培养方法评价靶细胞毒性是测试受试物质的传递剂量，与动物试验相比，具有较高的灵敏度。l 安全因素 （Safety Factors）- 毒性测试中从一个体系外推到另一个体系具有很大的不确定性（如从动物外推到人类），为此安全因素被用来考虑物种内与物种间的变化。这种变化需要在非人类测试体系中能增加预期的人的剂量。l 可溶性特征 （Solubility Characteristics）- 医疗器械中的主要材料是非水溶性的，意味着材料中不到1/10000的用于获得理想的物理的、功能性的、制造性的和无菌性能等的部分是可溶的。可溶性成分可以从非溶解性材料中析出。l 细胞毒性(cytotoxicity)：指的是在细胞水平上生物材料中的任何可能影响细胞代谢和蛋白质合成的因素对细胞的毒性作用（如细胞死亡、细胞膜渗透性改变、酶活性抑制等）。细胞毒性不同于影响细胞粘附的物理因素（如材料的表面电荷、亲/疏水性等）。l 体外细胞毒性试验是各种用于医疗器械的生物材料的主要生物相容性试验。只有确定了一种材料是否具有细胞毒性后，才能考虑进行更多的特定应用试验来评价材料的生物相容性。17l 包括美国材料与试验协会(ASTM)在内的许多监管机构和国际标准组织(ISO)已颁布了相应的细胞毒性测试及试验数据分析的标准规程。l 目前公认的体外细胞毒性检测试验包括直接接触试验、琼脂扩散试验和浸提试验。三种方法之间的差异在于受体材料与细胞接触的方式，具体方法的选用取决于受试材料的特性、试验方法的原理以及生物相容性评价数据的应用。细胞毒性的检测试验试验直接接触试验琼脂扩散试验浸提试验材料固体/浸提液固体/浸提液浸提液ASTM标准号F-813F-865F-619l 为了使这些方法标准化和比较这些试验结果，必须严格控制细胞数量的变化、细胞的生长状态（细胞倍增周期）、细胞类型、接触持续时间、受试样品大小（如几何形状、密度、外形、厚度）和表面积。l 为了提高试验结果的重复性（指定实验室内的数据可比性）和再现性（实验室之间的数据可比性），细胞毒性实验一般采用已建立的体外生长的细胞株（如从*美国模式培养物集存库 （ATCC）得来的），而不是来源于活体的原代细胞。l 细胞株是从原代培养细胞或细胞系中分离出来的、具有特异性状或标志性状的细胞群体。L-929小鼠成纤维细胞就是被广泛采用的一种细胞株。l 细胞株的选择是基于试验类型、研究者的经验、测量终点（存活力、酶活性、种属特异性受体等）和其他多种因素。l 为了确保试验系统的可操作性和合理性，通常必须在试验中包括阴性对照和阳性对照。*the American Type Culture Collection, Manassas, VA18l 直接接触法(Direct Contact Test)：将测试材料直接与细胞株接触，然后在培养箱中培养一定时间(24h)。期间，可溶出的化学物质会扩散到培养基中，直接和细胞接触。如果材料周围的细胞株出现畸形、退化和分解现象，就可以判定这种材料有细胞毒性。l 琼脂扩散法(Agar Diffusion Test)：将一块含有营养物的琼脂覆盖在培养好的细胞株上，然后把测试材料放在琼脂层上。材料中的溶出化学物质就会扩散到琼脂中并与细胞接触。如果琼脂层下方的细胞株出现畸形、退化和分解现象，就可以判定这种材料有细胞毒性。l 浸提法(Elution Test)：此方法用于判断测试材料萃取/渗出物的细胞毒性。一般会模拟实际使用状态或最坏的情况，首先用不同的萃取剂和条件萃取得到浸提液。然后将浸提液转移至细胞层中培养箱中培养一定时间，用显微镜观察细胞是否畸形、退化和分解。王远亮 等译， 生物材料生物学与材料科学的交叉，科学出版社，2009.19Advantages and Disadvantages of Cell Culture Methods任何生物学和化学试验，都有可能出现假阴性和假阳性结果。为了对结果作出正确的解释，应该慎重的评价受试材料和试验条件。5B.3 体内评价体内组织相容性试验、动物模型选择20l 体内评价是材料和医用装置用于人体移植前的重要评价步骤。在体外系统中获得的有关细胞和分子与生物材料作用的基本信息，并不能代替体内评价。为了解释说明生物材料与医用装置在体内发生的生物学效应，动物模型是很有必要的。l 从使用角度看，医疗器械组织相容性的体内评价是为了确定该器械既实现了预期的功能又不对患者或使用者产生明显的危害。l 因此，组织相容性体内评价的目的就是通过模拟临床应用的条件下评价、预测医疗器械是否会对患者存在潜在的危害。l ISO 10993 “医疗器械的生物学评价”标准，提供了医疗器械组织相容性体内评价的系统方法。l 所有的生物材料或者医疗器械体内组织相容性评价都要首先了解材料的化学组成和特性Biomaterials织相容性评价相关的生物材料和组成成分Assessment产of Tissue虑Compatibility加工所用的原材料使用的助剂、工艺污染和残留可沥滤物质降解产物其他成分以及它们在最终产品上的相互作用最终产品的性能与特点21与体内组 and Components Relevant to In Vivo（终 品评价应考 的因素）In Vivo Tests 组织Tissue Compatibilityl 致敏l 刺激l 皮内反应l 全身毒性（急性毒性）l 亚慢性毒性 （亚急性毒性）l 遗传毒性l 植入l 血液相容性l 慢性毒性l 致癌性l 生殖与发育毒性l 生物降解l 免疫反应致敏，刺激和皮内反应l 致敏试验是将待评价的器械、材料及其浸提液与豚鼠的皮肤接触，通过观察产生的致敏症状来评价引起致敏的潜能性。致敏反应是免疫系统对接触化学物质的一种反应。l 刺激试验主要强调利用生物材料的浸提液与完整的皮肤在规定的时间内相接触以确定潜在可溶出物的刺激作用。刺激是对化学物质的一种局部炎症反应，没有免疫系统的参与。l 皮内反应试验用于测定组织对皮内注射医疗器械、生物材料或最终的假体制品抽提液后的局部反应。当不能通过皮肤或黏膜试验来测定其刺激性时，可以应用皮内试验，最常用的动物是兔子。22体内for 相容性试验急性全身毒性、亚急性毒性和亚慢性毒性l 全身毒性试验是评价体内一次或多次接触医疗器械、生物材料或它们的浸提液后远离接触点的靶组织和器官发生的危害作用。这类试验可评价医疗器械释放入体内的成分产生的潜在全身毒性。这类试验还包括热原试验，用以评价诱发全身炎症反应的能力，通常通过发热现象进行判定。l 这类测试通常使用小鼠、大鼠或兔子作为动物模型。根据生物材料的预期应用，可以对受试动物使用经口、皮肤、吸入、静脉内、腹腔内或者皮下途径。l 急性毒性是指在给予单剂量或多剂量受试物后24h以内出现的不良作用；l 亚急性毒性（重复剂量毒性）是指在给予单剂量或多剂量受试物后在1428天内出现的不良作用；l 亚慢性毒性是指在动物生命期的一段期间内每天给予单剂量或多剂量受试物后出现的不良作用，该试验期不应超过试验动物生命期的10%，通常为90天。遗传毒性l 体内遗传毒性试验是在生物材料的某些特别组分或化学成分显示或者体外试验的结果表明具有潜在的遗传毒性（如DNA发生了变化）的前提下才可以进行。l 所指的体外试验应该包括三个水平的遗传毒性效应：DNA损伤、基因突变和染色体畸变（用细胞遗传学分析进行评价）l 体内遗传毒性试验最常用的是啮齿动物微核试验l 遗传毒性试验采用适当的材料浸提液或者将材料溶于适当介质中来进行23植入l 植入试验是将一种生物材料样品或者最终产品，通过外科植入或直接放入方式到达生物材料及医疗器械预期应用的植入部位或组织中，评价其对活体组织的结构和功能产生局部病理学影响的试验。应用组织学（显微镜下）评价可以表征各种生物学反应参数。l 对于12周内的短期植入评价，常选用小鼠、大鼠、豚鼠或者兔子作为研究使用的动物；对于长期植入皮下组织、肌肉、或者骨组织的试验，可选用大鼠、豚鼠、兔子、狗、绵羊、山羊、猪以及其他相对寿命较长的动物。植入体组织学评价决定的生物学反应参数u炎性细胞的数量和分布及其与材料/组织界面的距离u纤维囊的厚度和血管化程度u组织向内生长的性质和数量（多孔材料）u根据组织形态学变化确定褪变u出现组织坏死u其他参数，如材料碎片、脂肪浸润、肉芽肿、营养障碍、钙化、细胞凋亡、生物降解、血栓形成、内皮化、生物材料或降解产物的迁移24血液相容性l 血液相容性试验是评价与血液接触的医疗器械和材料对血液和血液成分的影响。体内血液相容性试验通常要设计模拟临床应用中的器械或材料的几何形状、接触条件和流体动力学。l 无论与血液接触时间长还是短都必须进行血液相容性试验的器械包括：与血路间接接触的外部接入器械、与循环血液接触的外部接入器械以及与血液接触的植入器械。l 血液相容性试验比较复杂、获得结果易误判，合适的表述是针对血液-材料间的相互作用涉及的多种参数的评价器械内无血栓大量血栓形成并附着大量血栓形成但脱落表面与血液具高度反应性，但聚集物通过小栓塞或溶解作用被迅速移除血液-材料相互作用的可能模式以及仅评价在固定时间点局部血栓形成的局限性。对器件C和D的检测将会得出这些材料具有血液相容性的错误结论25用于解释血液-材料相互作用试验结果的交变模式慢性毒性、致癌性l 慢性毒性试验用来测定受试动物的在一次或多次接触医疗器械、材料或其浸提液后的在亚慢性毒性之后的各种反应。慢性毒性试验可视为亚慢性毒性试验的延长。l 致癌性试验用来确定受试动物在其寿命的大部分时期里，一次或多次接触医疗器械、材料或其浸提液后发生肿瘤的潜能。因为与医疗器械相关的肿瘤非常罕见，所以只有当有其他来源的数据提示具有诱导肿瘤的倾向时，才进行致癌性试验。l 致癌性（致瘤性）和慢性毒性两者可以考虑在同一个试验研究中进行。26生殖和发育毒性l