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现代液相色谱进展 （潮州韩山师范学院化生系 郑惜珠521041广东）摘要 本文主要从液相色谱的发展史、固定相、流动相以及检测器四个方面综述了液相色谱的进展。关键词 液相色谱 固定相 流动相 检测器 色谱法是根据混合物中不同组分在互不相溶的流动相和固定相间具有不同的分配系数，吸附能力等，当两相作相对运动时，这些组分在两相间进行反复多次的分配，从而得到分离。它最初仅仅是作为一种分离手段。从而得到分离。直到五十年代，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，成为一种独特的分析方法，是几十年来分析化学中最富活力的领域之一，也是生命科学和制备化学中广泛应用的一种手段。色谱的发明者，俄国植物学家M.S.Tswett，是在研究植物色素的过程中，于1906年创立这种简易的分离技术，奠定了传统色谱法基础。从此之后，化学家、生物化学家和生理学家们在制备高纯化合物、分离和鉴定复杂混合物时便有了一条崭新的有效途径。自从有了这种手段，使许多过去被认为是单一的物质，判明却是多种化合物的混合物；许多化学反应的过程依靠这种方法而得以探讨；终于使许多复杂混合物，例如维生素、药物、色素、氨基酸等得到离析；这种方法甚至帮助科学家们了解了一些长期模糊不清的自然现象，诸如植物与动物的营养、激素对人和动物的生理特性、维生素在动植物体中的分布等等问题。Tswett 的实验意义很大，尽管他于1907年在德国柏林植物学会议上反复强调色谱技术，但并没有受到当时科学界的重视。经过二十五年后，德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。另外他还发现了八种新的类胡萝卜素，并把它们制成纯品，进行了结构分析。同年，他又把注意力集中在维生素的研究上。在确定了维生素A 的结构以后，于1933年从35000升脱脂牛奶中分离出一克核黄素（即维生素B2），制得结晶，并测定了它的结构。此外，他还用色谱法从蛋黄中分离出了叶黄素；还曾把腌鱼腐败细菌中所含的红色类胡萝卜素确定离析出来并制成结晶。正因为他的出色工作使色谱法名声大振，迅速为各国科学家们所注目，广泛被采用起来。1 液相色谱固定相1.1 正相色谱 八十年代初，人们使用的正相色谱固定相硅胶和吡啶硫 镍盐的络合物晶体能与芳香族化合物形成包合物用于分离芳香族含氮异构体和胆甾醇晶体。已有人1将焦炭吸附剂作为填料和键合硅胶作过比较并研究其热力学机理。具有离子化或非离子化功能团的大孔聚合物也开始应用于液相色谱，这些聚合物在整个酸碱范围内稳定，其中一个缺点是当溶剂改变时，它们会热胀冷缩，但是其主要的分析方面用途，即从水中收集痕量研究化合物是没有问题的，通过适当的处理装入色谱柱，一些物质出现过度的峰带变宽 ，而另一些则出现尖、窄的峰带和高分离度，在强碱性大孔树脂中120分钟内可分离100 种尿液中紫外吸收物质2。一般地，碱溶液会破坏硅胶，烷基胺比季铵盐更会腐蚀硅胶填料，故通过加填有5m m 硅胶的短预柱来洗脱碱性溶液。Kataev等3用聚三氟苯乙烯涂成的硅胶微粒基质并应用到卤代芳烃、多肽和蛋白质的分离。1993年11月，Majors 讨论了在日本发展迅速的HPLC 聚合物填料。Hosoya 制备了大孔聚合乙烯对叔丁基苯甲酸丁酯微球和两种别的聚合物微球的性能以及更多的C18HPLC固定相。1.2 反相色谱 到了九十年代，人们不断探索保留过程及相关烷基键结构的复杂性和可能制得的各种新型固定相。Bolok 和其合作者从统计技术研究反相色谱柱的老化过程 。Schmid与合作者论述了含饱和脂肪酸键合相的合成与性质，并且与相应的饱和烃固定相的使用作过比较。Pesek和Matyska合成了两种不同的二醇键合相 。Buszewki 等比较了烷基胺和烷基键合相基质用于反相分离，发现前者对分离极性化合物效果显著，但其热稳定性不如后者。Wongyai 用苯丙醇胺键合到硅胶上产生离子交换反相基质的混合模型，Friebe 将Calixarene键合到硅胶上研究其作为选择相能够形成类似于环糊精的内包合物。Chriswanto 和伙伴们将聚吡咯相涂在硅胶上作为HPLC 的特征化填料。Ge等合成了聚3辛环吡咯改性硅胶，评价其作为蛋白质的分离及探讨酸、碱介质的稳定性。Skapo和Simpson则在流动床中制得反相基质，他们总结出在有机溶剂中通过这种途径与常规键合相比较可制得重现性更好的基质。Theinpont 论述了在HPLC 柱中已经填装好的硅胶的衍生化过程和通过这种途径制得的色谱柱和常规键合相色谱柱进行了比较。1.3 亲和色谱 日本和欧洲较多研究多孔聚合物在液相色谱中的应用，这些聚合物可用于分离各种芳香族化合物和糖类，高分子填料对保留值有较大影响，依据不同溶剂洗脱次序，可估算出聚合物溶解度参数。它们适用于亲水溶质排阻色谱，如有一种吸附剂TSK-SW 硅胶带有亲水键合相，在较大的流速下能经受高压且有非常高的分离度，尤其适用于蛋白质和腐殖酸的分离。曾有人描述过带羟基、氰基、铵离子及芳基金属醚键合到硅胶上，铵离子键合相主要以氢键结合，通过溶剂作用稳定保留值。1.4 离子交换色谱 离子交换固定相的确研究过不少，如八十年代初流行的TSK型SW硅胶及基于二乙胺乙基(DEAE) 制成的阴离子交换材料用于蛋白质及核酸的优化分离，低聚糖的分离采用Micro-Pak AX-5。Sevec 和Frechet 5 制得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚二甲基乙烯丙烯酸酯色谱柱 (3008 mm) 用于蛋白质离子交换的制备色谱。他们能做到一次进样到这种色谱柱分离300mg 的蛋白质混合物。Gawdzrk 和 Matynia制备了一种交联的(p,p二羟基苯)丙烷二环氧甘油醚和二乙烯苯的甲基丙烯酸酯的多孔共聚物作为一种最新的HPLC填料并且评价了其作为正相和反相分离的效果。 Danielson 和其合作者6 用一种丙胺基硅基质同Kel-F800 反应制得一种弱阴离子交换填料。1.5 空间排阻色谱 Kato 等曾通过丁醚或三乙醇苯醚与TSK G3000 SW 空间排阻色谱法 (SEC) 结合合成 HIC 固定相材料，当使用盐溶液梯度洗脱时，可达到很高的分离度。Smigol7 论述了均相聚合甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚乙烯二甲基丙烯酸酯微球用特殊化功能的多孔介质制得二醇或二乙胺相有较大孔隙和十八烷基官能团有较少孔隙，这样制得的一种基质当所有分子接近极性相时，较少的分子进入多孔介质，而限制了大分子进入到十八烷基键合相中。 总之，不论是何种类型的固定相对于手性异构体的拆分以及蛋白质和多肽大分子的分离仍在不断的探索完善之中，从发展的趋势看，寻求各种高分子材料作为新型色谱固定相前景光明1.6 超临界流体色谱（SFC）80年代中期SFC技术的迅速发展开始受到我国学者的关注。90年代初周良模等18较早地对SFC技术进行了系统研究，设计了包括毛细管/微填充柱SFC。马熙中等对填充石英毛细管柱的串联使用行了研究，获得了很高的柱效和复杂组分的满意分离结果。他28还考察了包括温度，压力，密度以及固定相性质等参数对溶质保留行为的影响。2 液相色谱流动相 液相色谱应用广泛的是反相色谱，其流动相的优化组合直接关系到分离效果。八十年代二元流动相组成优化依赖于容量因子(k)的对数值与极性溶剂的摩尔分数关系，根据两者线性关系，可以估算溶质的保留值。六种等离子强度溶剂的结合被应用于产生六种三元流动相，用于分离大范围的化合物，这些混合物的极性通过增加极性溶剂来调节。Markl曾将有机磷和硫加入到流动相中可以调整硅胶表面，这些化合物吸附在硅胶表面由于氢键作用而改变了选择性和溶质的保留值。 Hitachi化学公司用于二甲基乙烯酰胺和二甲基聚丙烯酰胺流动相用无机酸调节PH 2 -6来分析PI2550使用二乙烯苯苯乙烯作填料，曾获得专利。Sentell和Henderson研究过C18 相作为温度和键合密度形状选择性并且发现低于室温和高键合密度固定相可获得较好的选择性，他们建立了范德荷夫座标图并且指出作为一种功能键合密度图形的差异。 聚合芳香烃的使用作为一种探测保留过程，尤其是对于相关的选择性引起人们浓厚兴趣。这些研究很成功，国际标准和技术协会已公布过这种标准参考材料作为评价反相柱的选择性，其中有两种观点，Sander和Wise8 发表过杰出的论文论述选择性及其评价这种性质途径。Skelly等开发计算机辅助选择内标物，可从90种内标物的数据库中依据保留时间的排列次序择其所用。溶剂化显色现象尤其利用Kamlet-Talf 公式近年来成为探索色谱保留值时髦的工具。这可从最近连续的报道中可以看出。不管研究流动相还是固定相其氢键效应仍然非常重要。Carr研究小组10仔细地测量了甲醇、乙腈、2丙醇和四氢呋喃(THF)水溶液混合物的氢键给体酸度并讨论了相关的反相色谱保留值。Carr小组12 另外也论述非常有价值的有关ET(30) 溶剂强度的限度，他们指出如果在整个溶剂范围内即从100水到100有机改良剂存在非线性化性，同时也应该再次强调，这也适合于别的单一参数溶剂，包括体积百分数对k作图和溶剂强度参数S。三元流动相组成溶剂的选择性及特性也是人们感兴趣的研究内容。Levin 等13 提出一种在二元流动相相关实验基础上预言三元流动相的保留行为。Heron 和Tchapla14 研究了非水介质反相LC的溶剂选择，发现Kaelble 三角图比众所周知的Snyder三角图更为有效.各种各样的研究有助于我们更好地理解流动相在保留过程中的作用。Chen和Pietrzyk表面选择性、有效性、线性烷基苯磺酸的分离度能通过流动相离子强度和电解质阳离子的选择得到提高。McCalley16 研究有机溶剂强度对一些基本化合物的峰型影响，发现THF和甲醇比乙腈作流动相有更好的色谱峰，尽管不同溶质的行为有相当大的变化.Olesik 研究小组的兴趣也继续集中在流动相的“增强流动性”上。当少量的二氧化碳加到传统的反相色谱流动相时，其粘度减少，扩散系数增大，柱效提高。Lee和Olesik研究了结合升高温度可进一步增大扩散系数和柱效，Cui和Olesik17 报道过应用基础化学对这些方法的改进，指出除了降低粘度外，二氧化碳也能破坏甲醇水混合物的氢键。3 液相色谱的检测器八十年代初便有各种各样的检测器问世. 有关检测器应用的论文成千上万。最流行的是可变波长检测器，而固定波长检测器由于最适合用于大范围的各种芳香化合物得到广泛应用. 折光指数检测器，主要是应用空间排阻色谱在高分子工业以及食品和饮料工业中糖的检测. 发展最迅速的是开变波长光电检测器和电化学检测器。Berthod 论述了LC中激光检测器的使用，他讨论LC检测器性能需要，相关激光性能，以及几个激光LC相结合的例子，包括光扫描、荧光、光电离子化、热光离子化、折光率、光度和声光检测器。Rochlin20 引用36篇文献比较不同类型的检测器。丁玉明等21采用MULTI检测器，配合进口SFE/SFC仪，二级管阵列紫外可见分光光度计(UV-VIS)对脂肪基质固体样品中的有机锡化合物的分离进行了研究。液相色谱新的检测技术不断发展，以适应毛细管和微球柱大小的需要，Fielden论述了近几年正在迅速发展的液相色谱检测技术，并将其分成二大领域，即光谱和电化学检测器。Martin等人论述了当今控制环境污染分析和监测方面面临的挑战，他们检验了多种分析技术，包括一些液相色谱仪，可以保证应用于控制环境污染问题，在相关的一篇综述中，Chau评价了可以提供分析金属离子的色谱技术，液相色谱技术同特殊元素检测相结合，可以分离金属络合物结构，对于大气、水、残渣和鱼样的金属离子分析具有重要意义。Schmitt等论述了如何合同放大二极基因组的样品作为内标物，在PCR基础上，在各种细胞和组织中主要基因组样品和成纤维细胞增长因子b 的液相色谱分析。各种各样检测器的研究论文层出不穷，如紫外可见光度检测器拉曼光谱检测器，荧光检测器，化学荧光检测器，质谱检测器，电化学检测器，核磁共振检测器以及光电二极管阵列检测器等等。总之，检测器的研究其共同的方向均朝着灵敏度高、重新性好、相应快、线性范围宽、适应范围广、对流动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特性。4 参考文献 1 Taylor P J, and Sherman P L. 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