微生物操作注意事项.doc

（一）样品的处理和稀释：1操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 2无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。 3采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 4样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。 在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。 为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。 5稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。 （二）倾注培养1操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 2倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。 倾注培养基的量规定不一，从1220ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。 3为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。 4培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。 5为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。 （三）计数和报告1操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 2到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。 3计数时应选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。 4若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 5不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。 6当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 7当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 8菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。一、实验目的 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法 掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法 二、实验器料 根据实验需要确定，常见的有： 培养皿 试管 锥形瓶 枪头 三、实验原理 为确保实验顺利进行，要求把实验所用的玻璃器皿清洗干净。为保持灭菌后的无菌状态，需要对培养皿、试管等进行包扎，对试管和锥形瓶等加塞棉塞。这些工作须严格进行操作，但如果操作不当或不按操作规定进行，则会影响实验结果，甚至导致实验失败。 灭菌是指杀死一定环境的所有微生物。微生物实验室常用的灭菌方法包括：直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌等。基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质变性，从而达到杀菌目的。 四、实验步骤 1 器皿洗涤 （1）不能用有腐蚀作用的化学试剂和硬度比玻璃大的物品来洗涤擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，然后冲洗干净。 （2）用过的器皿应立即洗涤。 （3）含有琼脂培养基的器皿，先将培养基刮到废液缸里，然后清洗。含有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。 （4）一般器皿可用洗涤剂进行清洗，然后再用清水冲洗干净。洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。 2 器皿包扎 （1）培养皿： 洗净的培养皿烘干后每10套（根据需要而定）叠加在一起，用报纸或牛皮纸包好，然后进行灭菌。 （2）试管和锥形瓶： 试管应用棉塞塞好，六到七支用牛皮纸包扎好进行灭菌。锥形瓶用八层纱布和牛皮纸进行包扎，纱布中间要凹进瓶口，可起到缓冲作用。 （3）枪头： 1ml以下的枪头放进枪头盒里，用报纸包好灭菌。5 ml枪头用长条形报纸逐只进行包扎，然后统一再包起来灭菌。 3 灭菌锅的使用 （1）干热灭菌： 先把要灭菌的物品放在箱内，堆积时要留有空隙，勿使接触烘箱壁，关闭箱门。接通电源，调节温度控制旋钮控制温度在要求的温度。灭菌结束后切断电源，待温度降至60时，才能打开箱门。 （2）高压蒸汽灭菌： 使用前先在锅内加入适量的水（以在支架处为宜），然后把需要灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺母，打开排气阀。 打开电源开关进行加热，待排气阀冒热气3-5min后，关闭排气阀。待第一次喷气结束后开始