HBV X蛋白结合共同转录因子ⅡB的研究.doc

HBV X蛋白结合共同转录因子B的研究HBV X蛋白结合共同转录因子B的研究2010-04-23 杨益大马亦林郑临村上清史 【摘要】目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBV X蛋白)能否结合共同转录因子B(TFB)。方法应用体外蛋白与蛋白结合试验(Pull-Down试验)和Far-Western Blot试验，以及细胞内联合免疫沉淀试验。结果HBV X蛋白能直接与普通TFB结合。HBV X的X199(51-99)是结合TFB的最小基团。研究还证实土拨鼠肝炎病毒X蛋白(WHX)同样能与TFB结合。细胞内联合免疫沉淀试验更进一步证实了体外蛋白与蛋白结合实验的结果。结论嗜肝DNA病毒X蛋白与TFB结合是其发挥反式转录激活作用的机制之一。 【关键词】乙型肝炎病毒X蛋白共同转录因子B结合 Study on the binding of HBV X protien to the general transcription factor B YANG Yida, MA Yilin, ZHEN Lin, et al. Department of Infectours Diseases, The First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310003 【Abstract】ObjectiveTo study the binding of HBV X protein(HBV X) to the general transcription factor B(TF B).MethodsPull-Down assay in vitro, Far-Western Blot assay and Co-Immunopreci-pitation assay in vivo were used to detect the binding of HBX protien to TF B. ResultsIt was found that HBX binded TF B directly and HBV X 199(51-99)is the minimal domain responsible for the binding to TF B. Furthermore, the binding of TF B-HBX in vitro was confirmed by intracellular co-immunoprecripition assay. It was also found that the woodchuck hepatitis virus X protien (WHX) was to bind TF B. ConclusionThese RE results suggest that the interaction between HBX and TF B maybe of the mechanisms which account for its transcription activity. 【Key words】Hepatitis B virus X proteinGeneral transcription factor BBinding 乙型肝炎病毒(HBV)X基因编码相对分子质量为17 000的X蛋白(HBV X蛋白)，具有反式转录激活作用，能广泛激活病毒和细胞的启动子的转录，在HBV复制，感染以及慢性HBV感染所致肝细胞癌(HCC)中均有十分重要的作用1。已报道的HBX结合蛋白有RNA聚合酶(RNA Pol )亚单位RPB5、TATA反应元件结合蛋白(TBP)及共同转录因子TFB2，3等。HBX是通过与这些因子以及许多未知的蛋白结合参与了转录的调节。共同转录因子B(TF B)是RNA Pol转录起始复合物(PIC)中的重要成分，它与TBP结合组成了PIC最基本结构；而且RNA Pol与TFB结合后才能进入PIC发挥其功能；同时TFB又是许多具有转录活性的病毒蛋白如单疱疹病毒的VP16、EB病毒的EBNA-2、猴病毒的大T抗原等结合的靶蛋白4，在转录调节中有重要作用。我们用不同的方法证实HBV的HBV X蛋白也能结合TFB，现将结果报道如下。 材料与方法 (一) 质粒构建 大肠杆菌表达质粒pGENK1购自Stragagene公司，表达谷胱苷肽S转移酶(GST)融合蛋白。本实验所有的GST融合蛋白中含有能被cAMP依赖蛋白激酶磷酸化部位。HBV X蛋白全长和截短(Truncated)突变体X-1、D1、D3、D5、X16、X199和GST-WHX融合蛋白表达质粒由日本金泽大学村上教授提供。TFB cDNA亦由村上教授赠送。全长TFB cDNA被插入pGENK1作为大肠杆菌(E.coli)蛋白表达质粒。构建方法以约0.5gTFB片段和1g pGENK1载体(Vector),加入1.5l Ligation High(Takara)在室温下放置2小时。将连接好的质粒在冰上放置1小时，同时从-80C冰箱中取出感受态细胞E.coli.XL-1 Blue(Stratagene)置于冰上融化，40l感受态细胞加于连接后的质粒中，再在冰上放置30分钟，然后置37C水浴箱中2分钟，再快速置于冰上2分钟，加入0.5ml SOC培养基，37C震荡温育30分钟，离心收集细胞，接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB培养皿中，37C温箱过夜培养。以5GST为正链引物，GSTR为负链引物，聚合酶链反应(PCR)法筛选出阳性克隆。 哺乳动物细胞表达质粒NKFlag Vector由日本金泽大学肿瘤所山下博士提供，该质粒含有EcoR和BamH酶切位点，全长HBV X蛋白片段(insert)以酶切方法取自pGENK1 HBV X蛋白-1，将0.5g HBV X蛋白片段，1g NKFlag Vector,1.5l Ligation High共同在室温下温育2小时，转化至XL-1 Blue感受态细胞，37C过夜培养。以T7为正链引物，HBXR为负链引物筛选阳性克隆。pUTPLTF B亦为哺乳动物细胞表达质粒由村上教授提供。所有突变体均经Taq测序试剂盒(Promega)和DNA测序仪(370A，Applied Biosytem)测序。 二、重组蛋白质的诱导和纯化 GST融合蛋白mol表达质粒转化至JM109大肠杆菌(E.coli.)，单菌落接种至含有Amp的LB培养基中，37C过夜培养，转种于250ml含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为0.4mol IPTG(isopropyl-D-thiogalac topyranoside)，30C培养56小时，离心收集细胞，溶解于PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.5,含1%Triton-100)，超声波细胞打碎仪打碎细胞后加入谷胱苷肽Sepharose 4B树脂(Pharmacia Biotech. Inc.)，4C旋转温育1小时，经PBST洗涤3次后，结合蛋白用10mmol/L还原型谷胱苷肽洗脱，蛋白质贮存于-80C。 组氨酸(Histidine)融合蛋白表达质粒被转化至BL-21(E.coli.)。细菌接种至含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为1mol IPTG，30C56小时培养后，收集细胞并由超声波粉碎仪打碎细胞，加入Nickle Sepharose树脂(Invitrogene Co.)，4C旋转温育1小时，用TBS缓冲液(50mol Tris HCl,pH7.5, 150mol NaCl,1%Triton-100)洗涤5次，然后由依咪哒唑(Imidazole)缓冲液(300mol Imidazole, 20mol Na2HPO4,500mol NaCl,pH4.0)洗脱，蛋白质贮存于-80C。 三、Pull-Down试验 约1g GST或GST融合蛋白被吸附于谷胱苷肽Sepharose 4B树脂上，在GBT缓冲液中(10%甘油，50mol Hepe