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多位点序列分型MultilocusSequencingTypingMLST 1 Contents 两种分型方法的比较 MLST的步骤 MLST的方案设计 MLST的由来 实例分析 2 多位点酶电泳 Multilocusenzymeelectrophoresis MLEE 根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异 3 MLEE的缺点 不能推断特殊位点的碱基序列不同实验室间的分型结果不能进行比较 4 MLST的首次使用 MLST是由多位点酶电泳 MLEE 衍生出来的一种分型方法在1998年 Maiden等首次将MLST应用于脑膜炎奈瑟菌分型 5 多位点序列分型 MLST 一种基于核酸序列测定的细菌分型方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段测定其序列 分析菌株的变异 6 MLST的原理 MLST方法一般测定6 10个管家基因内部400 600bp的核苷酸序列 每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号 每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱 也即是这株菌的序列型 sequencetype ST 这样得到的每个ST均代表一组单独的核苷酸序列信息 7 序列型 ST 序列型 Sequence typying STs 等同于MLEE得出的电泳型 Electrophoretictype ET 通过比较ST可以发现菌株的相关性 即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST 而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同 8 MLST分析方法 MLST技术针对看家基因设计引物对其进行PCR扩增和测序 得出每个菌株各个位点的等位基因数值 然后进行等位基因图谱 allelicprofile 或序列类型 sequencetypes STs 鉴定 再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵 matrixpair wisedifferences 等方法构建系统树图进行聚类分析 9 MLST方案的设计 三要素 选择经过初步筛选的菌株选择具有独特特征的基因位点设计用于基因扩增和序列测定的引物 10 1 菌株的选择 根据已有的分型方法和流行病学资料 选择100株左右具有代表性的菌株作为分析对象 理论上 这些选定的菌株要代表所研究细菌的群体 而不是仅仅包含那些对人致病的克隆 收集的菌株最好具有代表性 不仅仅由一个亚型组成 11 2 管家基因的确定 全基因组序列的测定大大方便MLST位点的选择一般选择10到20株菌评价10至15个备选位点 最终采用7个位点进行后续实验和分析 如果需要提高分辨力 可以加入个别非保守的基因 例如表面抗原基因或者毒力基因 这样比增加管家基因的个数将更有效 12 3 引物的设计 目的片段长度 400 600bp所有引物调整为同一退火温度 以适用于大范围流行病学监测和群体研究为了发现引物结合位点可能存在的变异 每个位点都应该设计一对以上引物 13 http pubmlst org 实际运用中 对于已有的成熟MLST方案的细菌 可直接从MLST数据库中获取方案 http pubmlst org 14 15 16 17 18 MLST的步骤 三 结果分析 19 结果分析 根据分析的细菌群体组成1 以等位基因编号和ST编号为基本分析单位提交到MLST分析网络服务器 START和eBURST2 直接分析核苷酸序列上传到GenBank比对服务器进行BLAST比对验证 20 数据分析得到等位基因图谱 新的STs则找出对应的clonalcomplex 在数据库中找出相应的STs 群体进化研究 分子流行病学研究 菌群结构调查 菌群遗传学分析 疾病的全球性监控 鉴定暴发性疾病的病原体 MLST结果分析流程图 21 ST和克隆型 遗传学上具有相关性但并不相同的细菌的集合 被称为是同源复合体 Theclonalcomplex 也叫克隆型 以其核心的基因型来命名 22 MLST和PFGE的比较 两种不同的分子分型技术 23 不同分子分型方法比较 24 MLST和PFGE的比较 两种不同的分子分型技术 脉冲场凝胶电泳 PFGE 比较所确定的高度变异片段高分辨力不适于进行全面的流行病学调查及生物进化分析不同实验间重复性较差标准化技术数据库 多位点序列分型 MLST 比较进化较慢的位点标准化技术数据库不同实验室间重复性好不适用于同血清型菌株间比较 25 MLST实例分析 26 1 MLST方案 同MLSTDatabase 27 2 核酸序列信息的获取 2 1样本来源54株结肠弯曲菌 C coli 分离于2002年零售禽肉中 均为不重复菌株2 2PCR扩增2 3测序 28