蕨菜黄酮类化合物的提取与分析.doc

蕨菜黄酮类化合物的提取与分析摘 要:用70 %乙醇提取蕨菜黄酮类化合物,得到粗黄酮,经聚酰胺纯化,得到精制黄酮。利用分光光度法测定了蕨菜粗黄酮、 精制黄酮中的黄酮含量,利用聚酰胺薄膜层析法及颜色反应并与标准品芦丁、 槲皮素的试验做比较。结果表明:蕨菜干粉中总黄酮含量为 7. 28 % ,粗黄酮、 精制黄酮中黄酮含量分别为27. 03 %和41. 25 %。蕨菜黄酮类化合物主要是黄酮和黄酮醇两类,其中含有芦丁成份。聚酰胺纯化有一定效果,但纯化过程中约70 %黄酮损失。蕨菜别名拳头菜、 龙爪菜、 如意菜等,是药食两用植物,经常食用蕨菜会有一的保健作用。它是采自蕨科蕨属中的蕨 ( Pteridium aquilinum var . latiusculum )的幼嫩叶。作为药用,蕨菜具有清热滑肠,降气化痰,利水安神,降压等功效9 作为食用,自古以来就被人们视为山珍野菜。如今更因其生长在山林野地,少受污染,并富含对人体有益的多种营养成分,而倍受人们青睐。对蕨菜黄酮的提取、 纯化及含量测定进行了研究,并进行了吸收光谱测定、 聚酰胺薄膜层析定性分析黄酮成分等若干分析,为蕨菜的深度加工与保健功能研究提供依据。近年来人们对蕨菜的常规营养成分及其采摘加工甚至人工栽培等方面都有了不少的研究，但是有关蕨菜黄酮类物质的研究却鲜见报道。1 材料与方法1. 1 材料采摘蕨菜长出地面 1520cm 高的幼嫩叶(嫩叶拳卷期)为试验材料。采摘地点:六安市郊区的丘陵林地。1. 2 仪器与试剂TU21201 紫外可见光分光光度计,WFH2203 型三用紫外分析仪,HH24 数显恒温水浴锅,聚酰胺薄膜,芦丁,槲皮素,其余试剂均为国产分析纯。1. 3 蕨菜黄酮的提取与纯化1. 3. 1 蕨菜总黄酮的提取:新鲜蕨菜 70 烘至 8 成干,然后剪成23mm碎段,再 103 烘干后研成粉末状。准确称取一定质量蕨菜干粉,用索氏提取法(乙醚为抽提剂,45 水浴)脱脂及除脂溶性色素,当乙醚抽提液无色时挥尽蕨菜粉中乙醚,将蕨菜放在烧瓶中加入 70 %乙醇回流提取蕨菜总黄酮:第一次浸提加入蕨菜干粉重量的 5倍体积70 %乙醇,以后每次浸提加入 3 倍体积 70 %乙醇,每次浸提约2h ,浸提温度为90 ,直到乙醇浸提液基本无色,共浸提10 次。合并所有浸提液并适当浓缩,定容至一定体积,按此体积1 1 加入石油醚再次脱脂,弃上层石油醚,将下层乙醇浸提液定容至蕨菜干粉重量的 20 倍体积,此为蕨菜总黄酮提取液,简称为粗黄酮液。取一定体积粗黄酮液在水浴中进行减压浓缩成浆状并于103 烘干,粉碎得到粗黄酮粉,可计算粗黄酮粉得率。1. 3. 2 蕨菜黄酮的初步纯化:称取粗黄酮粉 1. 30g ,加水约100ml ,经水浴加热溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先已105 活化1h) ,装柱30cm高,柱内径为2. 5cm。上柱充分吸附后,先用蒸馏水洗至无色,然后用 95 %乙醇洗脱,洗脱速度约为 1. 5ml/ min ,洗脱至无色时为止,收集洗脱液在90 水浴上蒸干后于 103 烘 2h ,得粉末状精制黄酮粉,并可计算其得率。1. 4 蕨菜黄酮提取物及芦丁的吸收光谱测定取适量体积粗黄酮液用 70 %乙醇稀释,再取适量精制黄酮粉及芦丁分别用 70 %乙醇溶解,将上述三种黄酮液分别在可见光范围及紫外光范围,以 70 %乙醇为对照进行扫描,得到吸收光谱。1. 5 蕨菜黄酮提取物的颜色反应分别取0. 1g精制蕨菜黄酮粉、 0. 01g 芦丁用 70 %乙醇定容至100ml ,连同粗黄酮液共三个样,参照文献中方法8 ,9 ,10 ,11进行下面的定性颜色反应。1. 5. 1 浓硫酸试验:分别取粗黄酮液、 精制黄酮液、 芦丁液约1ml 于试管中,加入浓硫酸数滴,混匀后,喷在滤纸上,吹干,观察现象。1. 5. 2 HCl2镁粉反应:分别取粗黄酮液、 精制黄酮液、 芦丁液约1ml 于试管中,加入少量镁粉,再加几滴浓 HCl ,沸水浴加热,观察现象。1. 5. 3 AlCl3 反应:分别取少量粗黄酮液、 精制黄酮液、 芦丁液涂于滤纸上,吹干后喷 1 %的 AlCl3 乙醇液,再吹干,观察现象。1. 5. 4 FeCl3 反应:分别取粗黄酮液、 精制黄酮液、 芦丁液约1ml 于试管中,加入数滴 1 %的 FeCl3 水溶液,摇匀,观察现象。1. 5. 5 氨水反应:分别取少量粗黄酮液、 精制黄酮液、 芦丁液涂于滤纸上,吹干,再将滤纸放在氨水上方熏 0. 5min左右,观察现象。1. 5. 6 NaOH试验:分别取粗黄酮液、 精制黄酮液、 芦丁液约1ml于试管中加入几滴1 %NaOH溶液,摇匀,观察现象。1. 6 黄酮含量测定采用分光光度法测定黄酮含量,即利用黄酮类化合物与铝盐生成红色络合物,以芦丁为标准品,在510nm处测定吸光度。标准曲制作:准确称取已于 105 条件下烘至恒重的芦丁标准品 10. 0mg ,用 70 %乙醇定容至 100ml。精确吸取芦丁标准液0. 0、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0ml 分别置于6支试管中,并将各管加水补足至5. 0ml ,加入5 %NaNO2 溶液0. 3ml ,摇匀,放置 6min 后,加 10 %Al (NO3 ) 3 溶液 0.3ml 摇匀,放置6min ,再加4 %NaOH溶液4ml ,加水0. 4ml ,摇匀,放置15min后于510nm 处测吸光度(以不加芦丁的空白管为对照调零) 。所得数据经回归处理可得到标准曲线的回归方程。取一定体积样品液按标准曲线相同方法操作测得吸光度后,由回归方程计算出黄酮含量。同时对芦丁及蕨菜黄酮与铝盐生成的红色络合物在紫外及可见光区进行扫描得出黄酮2铝盐络合物的吸收光谱。1. 7 蕨菜黄酮的聚酰胺薄膜层析定性分析用70 %乙醇配制0. 1 %的精制黄酮液,用70 %乙醇分别配制 0. 01 %的芦丁及槲皮素液,连同粗黄酮液共四种溶液分别点样在聚酰胺薄膜上,以甲醇 冰乙酸 水 =90 5 5为展开剂进行上行层析,以1 %AlCl3 乙醇液为显色剂,显色后分别在可见光及紫外光下观察层析结果。2 结果与讨论2. 1 蕨菜黄酮提取物与芦丁的吸收光谱蕨菜粗黄酮、 蕨菜精制黄酮及芦丁的 70 %乙醇液的紫外光范围与可见光范围的吸收光谱见图1、 图2。由图1知,三种溶液在 206nm 附近皆有最大吸收峰。而蕨菜精制黄酮与芦丁在260nm附近又有第二个吸收峰。但芦丁在360nm处的吸收峰,另外二者没有。由图 2 看出,蕨菜粗黄酮及精制黄酮皆在 660nm 附近有一明显吸收峰,而芦丁液无。可见光谱上存在的差异,导致溶液的颜色也有所差异,蕨菜黄酮提取物的 70 %乙醇液呈黄色,而芦丁的70 %乙醇液则呈黄绿色。因为蕨菜黄酮提取物是一混合物,即使通过聚酰胺纯化仍为混合物,所以表现出与芦丁吸收光谱有较大差异。2. 2 蕨菜黄酮提取物的颜色反应试剂可见光紫外光粗黄酮精制黄酮芦丁粗黄酮精制黄酮芦丁浓硫酸灰黄黄色黄色黄绿色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光三氯化铝淡黄淡黄黄色黄绿色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光氨水淡黄淡黄淡黄亮黄色荧光亮黄色荧光灰黄色荧光三氯化铁深绿深绿深绿盐酸镁粉红色红色红色氢氧化钠黄色黄色黄色 蕨菜黄酮提取物与芦丁的定性颜色反应结果见表 1 ,可以初步得出蕨菜黄酮类物质主要是黄酮类及黄酮醇类,其母核结构见图示。2. 3 蕨菜总黄酮含量的分析测定2. 3. 1 芦丁、 蕨菜黄酮与铝盐生成红色络合物的吸收光谱分别扫描芦丁、 蕨菜黄酮与 Al (NO3 ) 3 反应生成的红色络合物,得可见光吸收光谱,见图 3。将芦丁、 蕨菜黄酮与Al (NO3) 3 反应生成的红色络合物用水适当稀释,在紫外光区扫描,得到紫外光吸收光谱,见图 4。由图 3 可知,芦丁、 蕨菜粗黄酮、 蕨菜精制黄酮与Al (NO3) 3 形成的红色络合物在可见光区的最大吸收波长皆为 510nm ,且光谱曲线特征相似,这与文献12 报道的大血藤黄酮与 Al (NO3 ) 3 反应的结果是一致的。因此,可以以芦丁为标准,采用与 Al(NO3) 3 反应生成的红色络合物在510nm处比色测定蕨菜黄酮含量。图4 证明芦丁、 蕨菜黄酮与 Al (NO3 ) 3 生成的红色络合物的紫外光吸收光谱也非常的相似,且在253nm处有一显著吸收峰,提示有可能采用紫外分光光度法在 253nm 处定量测定蕨菜黄酮含量,这需要进一步探讨。2. 3. 2 测定黄酮含量的标准曲线:按标准曲线制作方法操作,在 510nm 测定吸光度,得到标准曲线的回归方程为:C = 0. 8487A + 0. 0097 , C 为芦丁浓度 mg/ ml ,A 为510nm吸光度,相关系数 r = 0. 9998。2. 3. 3 蕨菜干粉的总黄酮含量:取一定体积的蕨菜总黄酮提取液(粗黄酮液)测定其中黄酮含量,进而计算出蕨菜干粉的总黄酮含量为 7. 28 %。蕨菜总黄酮含量比柚皮粉2 ,银杏干叶3 ,4 ,黑刺菝葜干粉7 ,穗醋栗叶片干粉11 中黄酮含量高的多,至少都高出 2 倍以上。蔡建秀等13 对22 种药用蕨菜植物研究结果显示,有 8 种蕨类植物的地上或地下部分黄酮含量超过了 3 % ,但除乌蕨地上部分黄酮含量特别高,达干重的 34. 24 %外,其余蕨类黄酮含量尚未有达 7 %的,而蕨菜中黄酮含量高达 7. 28 % ,说明蕨菜是极好的富含黄酮类化合物的植物资源。2. 4 粗黄酮粉、 精制黄酮粉得率及其黄酮含量由蕨菜干粉得到粗黄酮粉的得率为 25. 92 % ,经测定粗黄酮粉中的黄酮含量为 27. 03 %;由粗黄酮粉经聚酰胺初步纯化后的精制黄酮粉相对于蕨菜干粉的得率为5. 10 % ,相对于粗黄酮粉的得率为 19. 67 % ,精制黄酮粉中的黄酮含量为41. 52 %。从上述结果看出,蕨菜中黄酮类物质含量很高,提取的粗黄酮粉得率已达蕨菜干重的四分之一以上,虽未经纯化但其黄酮含量已达 27 %以上。经过初步纯化的精制黄酮粉得率也达蕨菜干重的 5 %以上。这些都说明,蕨菜是获取黄酮类物质的很好来源,利用丰富的野生蕨菜资源来提取制备黄酮类化合物有着很大的潜力和价值。这也同时为长期食用蕨菜会有一定的保健功能提供了依据。2. 5 聚酰胺初步纯化的效果经聚酰胺纯化后,黄酮粉中的黄酮含量由纯化前的27. 03 %提高到了纯化后的 41. 25 % ,这说明纯化有一定效果,但比文献5 中报告的蒲公英黄酮类化合物的纯化后黄酮含量达 67. 4 %要低的多,这说明聚酰胺对不同的黄酮提取物的纯化效果有差异,甚至差异很大。结合黄酮粉得率及黄酮含量计算纯化后的黄酮回收率为 30. 22 %。黄酮回收率( %) = (精制黄酮粉得率 精制黄酮粉中黄酮含量) / (粗黄酮粉得率 粗黄酮粉中黄酮含量) ,约 70 %的黄酮类物质在纯化过程中损失掉了。从图1 中曲线1、 2 看出,聚酰胺纯化前后的吸收光谱的曲线特征虽然发生了一定的变化,但结合后面的层析结相同,这说明通过聚酰胺纯化并未改变黄酮粉中的混合物质的组成成分。综合分析,聚酰胺纯化有一定效果,但如何进一步提高蕨菜黄酮粉中的黄酮含量,提高纯化过程中的黄酮回收率,尚需进一步研究。2. 6 蕨菜黄酮的聚酰胺薄膜层析结果斑点Rf值斑点Rf值可见光紫外光（365nm）B10. 875C10. 875无色亮蓝色荧光B20. 734C20. 719无色亮蓝色荧光B30. 672C30. 656无色亮蓝色荧光B40. 609C40. 609无色亮蓝色荧光B50. 516C50. 516黄色黄绿色荧光B60. 438C60. 438无色黄绿色荧光B70. 344C70. 344无色黄绿色荧光B80. 250C80. 250无色黄绿色荧光B90. 155C90. 141无色黄绿色荧光A槲皮素0. 141亮黄色黄绿色荧光D芦丁0. 523黄色黄绿色荧光 表2、 图5 为蕨菜黄酮的聚酰胺薄膜层析结果。根据Rf 值及斑点颜色初步可以判断蕨菜黄酮中有多种黄酮物质组成,其中粗黄酮、 精制黄酮的 B5、 C5 斑点的 Rf 值为0. 516 与芦丁的 Rf 值0. 523 非常接近,而且三者在用 Al2Cl3 显色后无论在可见光还是紫外光下的斑点颜色都完全相同,说明蕨菜黄酮中含有芦丁(即芸香苷,32 2芸苷糖苷基槲皮素) 。B9斑点的的 Rf 值为 0. 155 与槲皮素的 Rf 值相近,C9 斑点的Rf 值为0. 141 与槲皮素Rf 值相同,且三者在紫外光下皆呈黄绿色荧光,但是在可见光下槲皮素呈明显的亮黄色,而B9、 C9 斑点看不到亮黄色,这可能是在B9、 C9斑点处所含黄酮的量太少造成的,因此,蕨菜黄酮中可能还含有槲皮素(即 5 ,7 ,3 ,4 2四羟基黄酮醇) ,这与其它的黄酮组分一样尚需进一步研究确定。参 考 文 献1 戴宝合.野生植物栽培学.农业出版社 ,1997. 136139.2 杨洋 ,韦小英.柚皮黄酮类化合物提取方法和抗氧化性的研究.食品与发酵工业 ,2002 ,28 (6) :912.3 田呈瑞 ,李昀.银