产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的基因型分布和耐药现状.doc

产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的基因型分布和耐药现状【关键词】 大肠埃希菌 AmpC酶大肠埃希菌广泛存在于自然界,属于肠道正常菌群,其作为条件致病菌是临床细菌感染的最常见病原菌之一。当机体免疫力低下时，大肠埃希菌可引起感染，其感染类型多样，感染部位也比较广泛。随着新的β-内酰胺类抗生素的临床应用，尤其是头孢菌素类在临床上的广泛使用，其耐药性问题日益严重。据文献报道1，大肠埃希菌临床分离率逐年上升，对常见抗生素的耐药性也呈现出明显的上升趋势，且对多种抗生素同时耐药，是一种多重耐药菌2，使其成为临床抗菌治疗中亟待解决的难题。近年来发现，染色体或质粒介导的超广谱β-内酰胺酶和AmpC β-内酰胺酶能使多种β-内酰胺类抗生素失活，被认为是导致大肠埃希菌耐药的最重要的两类酶3，由于质粒介导的AmpC酶基因可在同种或不同种细菌间广泛播散,给临床抗菌治疗带来困难,已引起广泛重视4。本文着重对大肠埃希菌产质粒AmpC β-内酰胺酶的耐药机制研究进展作一综述。1 β-内酰胺酶（BLA）概况 β-内酰胺酶是细菌最常产生的、能水解β-内酰胺类抗生素的一种酶。目前β-内酰胺酶的分类方法有Bush-Jacoby-Medeiros5的功能分类法和Ambler的分子结构分类法，可将BLA分成14组，或AD四类及六个亚类（a-f）。其中AmpC酶属于C类，1组。根据来源的不同，将AmpC酶分染色体介导产生和质粒介导产生两大类。近年来发现由质粒介导的AmpC酶越来越多。 细菌产β-内酰胺酶是其对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制6，大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制主要为产生抗感染药物的灭活酶（各种β-内酰胺酶）、细胞壁结构的改变如细胞外膜通透性下降（膜蛋白通道丢失或减少）、主动外排机制、抗生素作用靶位结构的改变即青霉素结合蛋白PBPs的改变（被修饰或获得新的细胞壁合成酶）7。其中产生β-内酰胺酶是大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因，质粒或染色体介导的β-内酰胺酶能水解β-内酰胺类抗生素分子结构中的β-内酰胺环使之失活，所以产酶菌在有β-内酰胺类抗生素作用的条件下还能生存。2 AmpC β-内酰胺酶（AmpC酶） AmpC β-内酰胺酶是1973年在耐氨苄西林的大肠埃希菌中首先发现的一种染色体介导的β-内酰胺酶。AmpC酶又称作头孢菌素酶，是由肠杆菌科细菌或（和）铜绿假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶8，由ampC基因编码。近年来发现，AmpC酶不仅由染色体介导，而且还由质粒介导9，且质粒介导者因其具有较快的传播速度和较强的耐药性，导致耐药性的广泛传播，引起了临床治疗的困难，开始逐渐受到人们的重视。2.1 AmpC酶的分类 根据来源不同，AmpC酶可分为染色体介导型和质粒介导型。根据产生的方式AmpC酶分为三类：诱导高产酶（诱导后产酶水平远远高于未突变株）、持续高产（无论诱导剂是否存在，都产生高水平AmpC酶）8。根据AmpC酶表达方式可分为野生型、基础型、高诱导型、去阻遏突变型。2.1.1 染色体介导的AmpC酶 根据染色体ampC基因表达是否具有诱导性，分为诱导型和非诱导型两种表达类型。诱导表达受染色体ampc操纵子调控，当诱导剂存在时，可激活结构基因ampC高水平表达而产生大量AmpC酶。ampC操纵子的结构基因是ampC，编码AmpC酶，ampC基因的表达与4种调节基因ampD、ampE、ampR和ampG相关10。 大肠埃希菌的染色体AmpC酶属于后者。大肠埃希菌染色体上的ampC操纵子与其他细菌染色体的ampC操纵子不同，天然缺乏调节ampR4，所以表达与诱导无关，呈低水平表达状态，酶产量非常低。表达量主要受启动子的强弱影响且受生长依赖型衰减子调控，临床意义不大。如果大肠埃希菌染色体AmpC基因的启动子或衰减子发生突变或者获得带AmpC基因的质粒，就有可能提高AmpC酶的产量。近年来发现，产AmpC酶的基因已开始由染色体向质粒转移，大多为非诱导型表达，可持续产生大量AmpC酶。2.1.2 质粒介导的AmpC酶 1988年，在美国普罗维登斯一家医院的肺炎克雷伯菌中发现第一个质粒介导的AmpC酶，命名为MIR-1。质粒介导的AmpC酶没有调控基因，呈持续高水平表达，属于持续高产酶。产生这种AmpC酶的细菌对临床危害最大，是临床微生物实验室检测的重点。研究表明，质粒AmpC酶在分子结构上与染色体编码的AmpC有不同程度的同源性。根据和不同种属的染色体AmpC酶的同源关系，质粒介导的AmpC酶可以分为以下几群11：弗氏柠檬酸杆菌群的LAT型以及某些CMY型、肠杆菌属的MIR-1和ACT-1型、摩氏摩根菌群的DHA-1和DHA-2、蜂房哈夫尼亚菌群的ACC-1型、气单胞菌群的MOX以及FOX型、以及其他的CMY类型等6群。编码AmpC酶的质粒常同时携带多种抗生素的抗性基因，如氯霉素、四环素、磺胺类及氨基糖苷类等，可能是多种耐药基因以整合子形式携带多个基因转位造成的，这对于大肠埃希菌多重耐药表型具有重要意义12。质粒能在不同细菌菌种、株间传播，将引起比染色体介导型AmpC酶更严重的问题。 世界首例质粒介导的AmpC酶是在1988年报道的13,14,迄今已报道的质粒AmpC酶有30余种15, 这些酶分布于世界各地。它们可在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌、弗劳地柠檬酸杆菌、产气肠杆菌和奇异变形菌中传播, 表现为多重耐药, 成为临床抗感染治疗较棘手的问题。目前, 世界范围内质粒酶以CMY-2型多见, 已散布法国、德国、希腊、印度、中国台湾、土耳其、英国和美国。在国内对质粒AmpC酶基因型的研究报道已逐渐增多，陈轶兰等16首次发现北京协和医院1株临床分离大肠埃希菌产ACT-1型质粒AmpC酶。上海王勇等17于2003年首次从肺炎克雷伯菌检出DHA-1型AmpC酶, 上海蒋燕群等182007年于大肠埃希菌中检出CYM-2型AmpC酶等等。到目前为止国内报道质粒AmpC酶主要为DHA-1型、ACT-1型AmpC16,17。3 AmpC酶的检测方法 由于AmpC酶引起耐药性的日趋附增加，因此简便、迅速、准确地进行AmpC酶的检测具有重要的临床意义。目前国际上尚无很好的方法检测质粒AmpC酶，因此许多医院未把AmpC酶检测作为临床实验室的常规工作开展。 AmpC酶和ESBLs有重要区别，ESBLs可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，不被氯唑西林抑制，且大部分产ESBLs菌对头霉素类如头孢西丁敏感；而AmpC酶则不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，可被氯唑西林等抑制剂所抑制，产酶菌对头孢西丁耐药。故可加β-内酰胺酶抑制剂来鉴别AmpC酶和ESBLs，也可应用克拉维酸+氯唑西林检测法，头孢吡肟+头孢西丁检测法10。此外，还可采用等电聚焦电泳法检测并确定AmpC酶的型别。现在一般实验室采用的是表型筛选试验和三维试验。AmpC酶表型筛选试验操作简便，快速省时，经济易行，结果基本可靠，多数实验室均可开展应用。三维试验是目前公认的质粒AmpC酶或持续高产AmpC酶的经典方法，但是操作比较繁琐。目前有很多报道可以采用分子生物学技术19（PCR）检测AmpC酶，通过特异性的引物扩增待检细菌中的特定AmpC酶的基因片段，分析其特定的核苷酸序列，即可确定待检细菌是否AmpC酶，还可检测AmpC的基因型别，此法准确可靠，可用于新基因型别的发现。但因其操作复杂、成本高、耗时，不便于临床使用，主要局限于少量耐药株的研究。4 AmpC酶的临床意义和治疗 质粒AmpC酶的特性和染色体AmpC酶基因相同,其耐药谱大于ESBL s,不仅对一、二、三代头孢菌素及氨曲南耐药,而且也对头霉素和酶抑制剂耐药,有报道AmpC 酶合并膜孔蛋白OmpF 和OmpC丢失造成对碳青霉烯类药物耐药20,21。随着耐药菌株的不断增加， 质粒介导AmpC酶的菌越来越多，危害也越来越大，临床上治疗产质粒AmpC酶细菌引起的感染时,可选择的药物继续减少,也再一次说明抗生素的使用现状和前景不容乐观。微生物室工作人员务必要弄清AmpC酶的耐药机制、耐药特性以及检测方法，从而更有效地监测细菌耐药性变迁，指导临床抗生素的合理应用及开发、对研制新型抗生素起到积极推动作用，对质粒介导的持续高产型AmpC酶的及早发现并控制其传播具有重要的意义。 目前，治疗产AmpC酶大肠埃希菌所引起的感染，应首选碳青霉烯类抗生素和第四代头孢菌素22。尽管碳青霉烯类抗生素是AmpC酶的强诱导剂，但其抗菌活性很强，能在诱导产生足量的AmpC酶之前快速地杀死细菌，且对AmpC酶高度稳定。第四代头孢菌素（头孢吡肟）由于和AmpC酶的亲和力显著低于三代头孢菌素，而且对高产AmpC酶细菌的抗菌活性还比较好，可以用于产AmpC酶菌感染的治疗。但是我们还应注意到，产AmpC酶的大肠埃希菌可以同时携带ESBLs基因，这样对第四代头孢菌素有可能产生耐药。另外，非β-内酰胺类抗生素如某些喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素仍然保持着一定的敏感性，也可以考虑，但应根据药敏结果用药。 综上所述，产质粒AmpC酶的大肠埃希菌耐药谱广，播散范围大，CLSI针对大肠埃希菌只有ESBLs 的检测标准，而无检测AmpC酶的诊断方法，增加了检测和治疗这些产酶株的难度。所以对产AmpC酶大肠埃希菌的基因型和耐药性进行调查研究，从而指导临床合理使用抗生素，减轻抗生素的选择压力，为有效治疗和控制由其引起的医院感染具有重要的实际意义。【参考文献】 1 韩伟，张铁，王春光，等.大肠埃希菌耐药机制研究进展J.动物医学进展,2006,27(1):5153.2 Joumana N Samaha-Kfoury,George F Araj. -内酰胺酶和超广谱-内酰胺酶的研究新进展J.英国医学杂志中文版,2004,7(4):220224.3 王艾琳，李坚，张维瑜，等.肠杆菌科细菌产AmpC酶及超广谱-内酰胺酶的研究J.北华大学学报（自然科学版）,2005,6(4):314316.4 Philippon A,Arlet G,Jacoby GA.Plasmid-determined AmpC-type beta-lactamasesJ. 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