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血液细胞分析仪基础知识讲座 1 血液细胞分析仪原理与关键技术讲座大纲 血液检验的地位 血液的常识 血细胞分析仪的知识 血液细胞分析仪示例 血液细胞分析仪的展望 本次讲座重点内容 1 血液细胞分析仪的基本原理2 白细胞的分类3 如何保证产品的质量4 PE6000液路分析 血球仪的发展史 42年美国科学家库尔特发明了用电阻法计数粒子的专利技术 56年他又将这一技术应用于血液细胞计数获得成功 62年我国第一台血细胞计数仪在上海研制成功 60年代未血球仪除完成血球计数外增加了血红蛋白测试 HGB 70年代血小板计数问世 80年代开发了血细胞3分类 5分类 90年代开发出可对网织红细胞计数的分析仪 同时5分类及幼稚细胞检测更成熟 并发展成为血细胞分析流水线 医学检验包括 临床生物化学 临床微生物学 临床免疫学 临床血液学和临床基础检验学 临床检验 临床检验学 着重对人体血液 尿液 粪便及其它体液和分泌物进行检查 血液检验是临床检验中最常用 最有效的基本内容 血液检验的作用 对各种系统疾病的诊断和鉴别 是诊断各种血液病的主要依据 一 血液的基本知识 血液的组成 血液的概况 血液是由血细胞和血浆组成 血细胞包括红细胞 血小板和白细胞 血浆中包括各种蛋白 抗体 酶类等 无机盐 激素 维生素和代谢产物 水分占91 92 理化特征 红色 血红蛋白 不透明 含量占体重的7 9 约5L Ph值为7 35 7 45 比重为1 05 1 06 相对粘度为4 5 渗透压为2 6 3 9kPa 血液的功能 通过循环系统与全身各个组织器官密切联系 参与机体呼吸 携氧和排出二氧化碳 运输 将营养物质运送到器官组织 将体内代谢废物运往肾 肺等器官排出体外 防御 血液中白细胞和抗体参与机体抗感染和其他免疫反应 调节 调节体液渗透压 酸碱平衡和体温平衡 将正常血液抗凝离心后得到沉淀的血液 液体的血浆占50 60 血细胞占40 60 白细胞 血小板 红细胞 血液的基本组成 血浆白细胞和血小板红细胞 血细胞的分类和形态 寿命 7天120天8天直径 60 120fl120 1000fl2 30fl 20um 6 7 7 7um 2 3um 功能 抗感染 免疫携氧 代谢产物凝血功能 白细胞红细胞血小板 白细胞的种类 中性粒细胞 75 单核细胞 5 淋巴细胞 25 嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞经过瑞氏染色后的各种白细胞 血细胞的发育过程 共同的母细胞 造血多能干细胞单核细胞 原单核细胞 幼单核细胞 单核细胞 白细胞的发育 原始粒细胞 早幼粒细胞 嗜酸性中幼粒细胞 嗜酸性晚幼粒细胞 嗜酸性杆状核 嗜酸性分叶核 嗜碱性中幼粒细胞 嗜碱性晚幼粒细胞 嗜碱性杆状核 嗜碱性分叶核 中性中幼粒细胞 中性晚幼粒细胞 中性杆状核 中性份叶核 红细胞的发育 原红细胞早幼红细胞中幼红细胞晚幼红细胞成熟红细胞 血细胞分析仪的知识 手工法检验的过程 1 细胞计数 红细胞 白细胞 血小板等血细胞的镜下计数 2 定量血红蛋白3 白细胞分类 瑞氏染色 4 其它 血细胞比积 红细胞形态 嗜酸球计数等 血球仪发展 50年代 80年代 半自动 需将样本经机外稀释后才能检测 易受干扰 随机误差也大 80年代后 全自动 血液直接被吸入血液细胞分析仪后 在机内自动稀释 自动加溶血素 定时检测 有较高的精确度和准确性 血球仪发展 近年 联合型血液细胞分析系统 将血细胞分析 涂片机 染片机 网织红细胞计数仪串联在一起 自动加样系统和真空采血管的应用 避免实验室的随机误差 提高工作效率 避免实验环节造成的血行感染 成为仪器发展和使用的潮流 血细胞分析仪的发展 50年代 库尔特发明电阻抗法库尔特原理 电阻抗法 根据血细胞是不良导体的性质 它通过微孔时就引起电阻的变化 电信号的变化被检测出来 血细胞分析仪的现况 国内 二级医院以上 全自动三分类二级医院以下 二分类或三分类或没有国外 全自动五分类 应用其它新技术 可检测幼稚血细胞 手工法血细胞分析仪 手工法操作过程的随机误差 实验器材的系统误差及检测方法本身的固有误差 计数不但费时费力 实验结果的精确性 准确性差 血细胞分析仪测量水平不断提高 测量参数不断增加 快速 高效 为临床提供更多有用的实验数据 工作原理 细胞分析原理 阻抗法血红蛋白测量 光电比色法氰化高铁血红蛋白 HiCN 测定法 其它参数 通过计算机内换算 白细胞分析原理 白细胞分析原理 加溶血素后 白细胞大小分布如下 第一群 小细胞区 35 90fl 淋巴细胞第二群 中间细胞 90 160fl 嗜碱性 嗜酸性 单核第三群 大细胞区 160fl以上 中性粒细胞 血细胞分析原理血小板分析原理 阻抗法 电阻阻抗法计数原理 血细胞分析仪是利用小孔换能装置实现的 是一个用阻抗法计数的核心部件 阻抗法测试传感器 见下页示意图 管内充满导电液体 两电极接上恒流电源 中部为一小孔 小孔孔径与细胞成比列 在负压的作用下 细胞通过小孔瞬间 排开等体积的电解液 使电解液的等效电阻瞬间变大 这个变大的电阻在恒流源作用下引起一个等比例增大的电压 细胞离开小孔电解液的等效电阻又恢复正常 直到下一个细胞到达小孔 这样细胞连续的通过小孔 就在电极两端产生一连串的电压脉冲 脉冲的个数与通过小孔的细胞数相当 脉冲的幅度与细胞的体积成正比 将这些脉冲经过整形 放大 计算 储存 处理 就得到了细胞分类 计数的原始数据 液路的计数实验 二 血球仪的三分类 2 白细胞的三分类 第一类 35 90fL 淋巴细胞第二类 90 160fL 嗜碱性 嗜酸性 单核第三类 160fL 中性粒细胞 白细胞直方图 血液细胞分析仪将白细胞按体积大小 电压幅值的高低 从35 450fL分为256个通道 每个通道1 64fL 细胞按大小放在不同的通道中 得到白细胞的直方图 第一群 35 90fL 淋巴细胞第二群 90 160fL 单核细胞 中间细胞 第三群 160fL 中性粒细胞 大细胞 WBC直方图 各种报警符号 RBC直方图 PLT直方图 氰化高铁血红蛋白 HiCN 测定法 红细胞溶解后 血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白 Hi 再与CN根结合生成稳定棕红色氰化高铁血红蛋白 HiCN HiCN在540nm有最大吸收峰 HiCN法具有操作简单 显色快且稳定 直接定值等优点 缺点 氰化物有剧毒 氰化钾 无氰溶血素 我公司已于03年研制成功 现已投入批量生产 血细胞分析的过程 标本的采集和运输 稀释标本或用全血上机分析 检验者对结果的判断和分析 编辑或修改病人报告 打印报告 重做 注意事项 保证采样的规范性 试剂对实验的影响 应尽量采用原装试剂和溶血素 操作的影响 标准物混匀 样品的混匀 三 血球仪的质量保证 质控物 QualityControl 血球产品 质控物 是用来标定出厂仪器的 标准 也是医院用来定期效准仪器的 标准 目前使用的 质控物 大多是进口产品 在 质控物 包装盒中供应商会提供一个参考 靶值 由于不同种类的仪器有其差易 供应商会提供的 靶值 仅供参考 生产商必须测定出与自己生产的仪器相符合的 靶值 供生产作标定用 质控物 QualityControl 用途 用于对血液细胞分析仪的质量控制 以保证仪器测定结果的准确性 用法 与真正血样的操作方式相同 用血液细胞分析仪对质控物进行检验 通过分析测量质控物所得到的数值来评估仪器的准确性 试剂成分 稳定的人类红血球 生物模拟血小板成分和固化红细胞 用于模拟白血球 以及含防腐剂的介质 溯源 溯源 就是找一台溯源标准机 称靶机 目前只有被检验行业公认的 库尔特 和 东亚 两家公司销售出的血球仪 它一定是被定期效准过 参数转移 一 首先准备一台被检产品的 标准机 取30 50只新鲜血 到选中 靶机 上测试 将测试报告连同血样在2小时内送到被检产品的 标准机 进行测试将测试数据分成3 5组 每10只为一组 统计各组在 溯源 的标准机上测试的各组各参数的均值 计算出总均值 例A 参数转移 二 统计各组在被检产品的标准机上测试的各组各参数的均值 计算出总均值 例B计算血样转移参数K1 K1 A B 将质控物到被检产品的标准机上测试3 5组 统计均值 例C计算质控转移参数K2 K2 B C 计算靶值 根据质控靶值 K1和K2计算出该批质控的靶值 提供给生产定标 每批质控到后都必须这样确定靶值 定靶值过程是一个精细的工作 一般由专人负责 定靶值过程接触新鲜血 要特别提醒 注意事项 定标 1 准备 定标液 质控液 本底测试 通过确认重复性好 最少3次 2 标定过程 设好进血模式手工法 新系数 目前系数 标定液参考值 测量平均值自动定标 仪器自动换算新的系数 仪器的定标和质量控制 校准物溯源 定标 维持仪器的准确性质控 检测可能存在的系统误差 保证重复性 对操作者的理论及操作水平有较高要求 血细胞分析仪测试参数 WBC白细胞数目 4 0 10 0X109 LRBC红细胞数目 3 5 5 50X1012 LPLT血小板数目 100 300X109 LHGB血红蛋白 110 160g LLymph 淋巴细胞数目 0 6 4 1X109 LMid 中间细胞数目 0 1 1 8X109 LGran 粒细胞数目 2 0 7 8X109 LLymph 淋巴细胞百分比 20 0 40 0 Mid 中间细胞百分比 1 0 15 0 Gran 粒细胞百分比 50 0 70 0 MCHC平均红细胞血红蛋白浓度 320 360g LMCV平均红细胞体积 80 0 99 0fLMCH平均红细胞血红蛋白 26 0 32 0pgRDW CV红细胞分布宽度变异系数 11 5 14 5 RDW SD红细胞分布宽度标准差 35 0 56 0fLHCT红细胞压积 36 0 48 0 MPV平均血小板体积 7 4 10 4fLPDW血小板分布宽度 15 0 17 0 PCT血小板压积 0 108 0 282 临床应用价值 一 诊断临床疾病WBCHGB和RBCPLT二 常规检查判断身体的健康情况和免疫能力 临床应用 血细胞参数的临床意义 红细胞计数 1 生理变异 随年龄和性别不同有差异 新生婴儿 位处高原 情绪激动可使红细胞增加 2 病理意义 先天性心脏病 慢性肺疾患 慢性一氧化碳中毒 高原病等慢性缺氧可刺激红细胞生成引起红细胞增加 严重呕吐 腹泻等引起脱水时 血液浓缩 红细胞相对增多 反之 慢急性失血缺乏造血原料 骨髓造血障碍等引起的贫血时 红细胞数减少 白细胞计数 1 生理变异 随年龄不同时间不同 季节不同 变异较大 早上低 下午高 饭前较饭后低 冬季较夏季高 激烈运动及体力劳动都可使白细胞数增多 2 病理意义 急性化脓性感染 如脓肿 扁桃体炎 肺炎 阑尾炎 脑膜炎 败血症等白细胞数增多 外烧伤 手术后 尿毒症等也会增高 障碍性贫血 部分急性白血病等造血干细胞疾病 某些传染性疾病如伤寒 黑热病 流感 传染性肝炎等白细胞数减少 血小板计数 1 生理变异 健康人血小板数较稳定 无性别 年龄差别 2 病理意义 血小板减少见于脾功能亢进 尿毒症 肿瘤骨髓转移等 白血病 败血症 障碍性贫血 溶血性贫血 骨髓增生综合症均可伴有血小板减少 血小板增多见于原发性血小板增多症 慢性粒细胞白血病 增多症 脾切除手术后等 骨折 出血也可引起血小板中性粒细胞增多 急性化脓性感染 粒细胞白血病 急性出血 溶血 尿 酸 汞 铅中毒 减少 伤寒 流感严重感染等 嗜酸细胞增多 慢性粒细胞白血病 癌转移 铅 铋中毒 减少 伤寒 副伤寒等 淋巴细胞增多 百日咳 传染性单核细胞增多症 慢性淋巴细胞白血病 麻疹 腮腺炎 结核 传染性肝炎等 减少 传染病急性期 放射病 细胞免疫缺陷等 血液细胞分析仪的特点 电子原理 光学原理 化学原理的综合光 机 电 生物 化学 流体力学 液 气的集成计算技术应用的典范 血液细胞分析仪发展现状 1 产品品种多样化 2 控制智能化 3 测试自动化 4 检测项目增多 5 系统网络化 6 先进测试技术在血液细胞分析仪中的应用 血液细胞分析仪中的先进技术 鞘流技术 灼烧技术 扫流技术 射频技术 防返流技术 微孔显影技术 多次计数 激光测试技术 自动进样 旋转阀 流式细胞术 特殊技术在血液分析仪的应用 计数周期的控制 时间控制 容量测定方法 标本处理技术 预稀释 静脉血双进样 自动进样及清洗 旋转阀 自动涂片及染片 全自动血液处理及分析系统 细胞计数准确性控制 重叠校正 脉冲编辑技术 三次计数表决 扫流技术 防返流技术 鞘流技术等 液路的计数实验 扫流 新的方法 容量 电导 光散射 VCS 测导法 阻抗与射频技术联合检测分类法 光散射与细胞化学技术联合应用 其它 多角度偏振光散射白细胞分类技术 MAPSS 分血阀 激光法 近十余年来 随着半导体激光器技术的进步 使用 相关试剂处理加激光加流式细胞术 方法的白细胞五分类血球仪成为当前的主流 激光法五分类血球仪使用光散射进行测量都是基于Mie散射理论 如东亚SF3000通过激光激发产生荧光进行血细胞分析成为高档机型的基本技术 如东亚XT1800系列 XE2100 激光法检测原理 670nm半导体激光器 五分类血球仪系统构成 试剂流体光学电路数据分析 多角度激光偏振光散射检测法 90 消偏振光散射将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来 0 前角散射光用来测定细胞的体积 10 狭角散射光用来测定细胞结构 90 垂直散射光对细胞内部颗粒及细胞质进行测量 鞘流技术 液体流动状态有一个分界点 这是一个常量等于2300 既称为雷偌数Re Re d v d 管内经 密度 v 流速 粘滞系数当Re2300时液流处于湍流状态 假设 流体为纯水 1 1 d 100 m代入公式计算得 v 23米 秒此值即是纯水的湍流 层流分界点 鞘流技术 鞘流技术 液路的湍流实验 液路的层流实验 液路的激光实验 射频检测原理 细胞壁不能使低频电流通过能通过高频电流细胞核的大小和密度不同 它们对高频电流的阻抗也不同 因此可以用来区分白细胞 射频与电阻抗联合检测原理 射频与电阻抗联合检测原理 电阻抗和射频电导 这种方法是分别采用四个检测系统来检测不同类型的细胞 淋巴细胞 单核细胞和中性粒细胞检测系统 在细胞悬浮淮中加入溶血剂使红细胞溶解 而使白细胞保持完整 细胞浆及核形态近似于生理状态 当这些细胞通过检测系统时 对白细胞进行电阻抗法 测量细胞体积 和射频电导法 检测细胞核和颗粒密度 的联合检测 结果将细胞分成淋巴细胞 单核细和中性粒细胞三个群体 嗜酸性细胞和嗜碱性细胞两种检测系统 在细胞悬浮淮中加入特殊的溶血剂 除嗜酸性细胞和嗜碱性细胞外 其他细胞均被溶解或萎缩 再对保持完整的嗜酸性细胞或嗜碱性细胞进行计数 幼稚细胞检测系统 在细胞悬浮淮中加入硫化氨基酸 由于占位不同 结合在幼稚细胞的氨基酸比成熟细胞多 且对溶血剂有抵抗作用 当加入溶血剂时 成熟细胞被溶解 只保留着可能存在的幼稚细胞用来计数 SYSMEX公司的SE9000血细胞分析仪 自动进样 五分类血球仪技术现状 全球只有为数不多的几家公司拥有五分类技术 国内还没有 基本方法都是阻抗 射频 散射和荧光的方法 各个公司在使用它们的时候所用的组合与侧重点不同 每种方法都与其独特的试剂系统紧密相关 主流技术是激光散射结合荧光的方法 技术现状 双角度散射 Sysmex公司在其产品SF3000上运用 低角度散射 1 5 反映细胞尺寸信息 Mie理论 高角度散射 6 20 反映细胞的内部形态 血细胞分析仪的基本工作原理 血细胞分析仪的类型电学型电阻型 利用血细胞通过微孔时瞬间的电阻变化产生脉冲电流而计数 电容型 利用电极间加高频 血细胞通过时 静电容量发生变化而计数光学型血细胞固定型 利用光散射计数 血细胞流动型 利用流体力学原理计数 血液细胞分析仪的评价 精确度携带污染重复性线性可比性 血液细胞分析仪的评价 精确度 准确性 取低 中 高值标本各十份 每份重复测定3次 存放2小时 重复上述测试 将所得结果进行统计学处理 可得到不同含量的精确度 变异系数CV值应满足仪器给定的范围 血液细胞分析仪的评价 携带污染率当分析仪分析状态稳定后 测试三次高值质控物 i1 i2 i3 立即测试三次稀释液 j1 j2 j3 血液细胞分析仪的评价 重复性用中值质控物 重复测量10次Mean 平均值 SD 标准差 CV 变异系数 n 测量次数 Xi 指定参数第i次测量值 血液细胞分析仪的评价 线性用稀释液将高值血样稀释为100 80 60 40 20 10 六种浓度的样本 每种浓度样本测量2次 取平均值作为测量结果 用最小二乘法分别计算出理论值 理论值与实际测量值的偏差应满足仪器给定的范围 血液细胞分析仪的评价 可比性在新仪器指标的测定尚无参考方法时 要对仪器进行评价 只能将仪器测试的结果与常规方法测试的结果相比较 如一致既为与常规方法有可比性 血球分析仪的组成 电路部分 液路部分 机械部分 软件部分 电路部分 CPU板 数据采集板 模拟板 MTB板 接口板 功率板 阀 泵 步进电机控制 传感器接口 液路部分 动力元件 泵 注射器换向元件 二通阀 三通阀计量元件 注射器 定量泵 计量管管路 钢管 胶管储能器件 真空室 压力室 隔离室 储液室等其他 过滤器 计数池 采样针等 经济价值 提高医院的技术水平 增强竞争力 吸引病源 高回报率 关注血球仪用户 血液细胞分析仪是医院进行血常规检查的必备仪器 在世界各地 在国内各级医院都得到了普及应用 对疾病的诊断何鉴别诊断起到了重要的作用 目前国内销售的血液细胞分析仪品牌很多 有日本东亚 美国 库尔特 等等 型号 规格也很多 给用户选购代来诸多不便 关注血球仪用户 医院在购买血液细胞分析仪时从以下几个方面考虑 1 实用性 医院应根据自身的能力和日检样本量确定购买何档次的仪器 一味订高档仪器 会带来购置何实用的浪费 2 仪器性能 至关重要 不能全听供应商的广告 宣传 要多听专家意见和走访仪器使用医院 3 性价比 现代血球仪的主要进展 随着高科技的引用和基础医学的发展 各种先进的血细胞分析测试技术被应用到血细胞分析仪上 87年Coulter公司发明的VCS Volume 体积 Conductivity 电导性 scatter 光散射 技术可使血液细胞未经处理与体内形态完全相同的状态下进行测试 而东亚 SYSMEX 的NE 8000和SF 3000采用了阻抗与射频技术联合的血细胞分类法 现代血球仪的主要进展 90年代后 仪器的自动化程度增高 测试速度达到120份 小时 可进行多参数分析 高达30余项 精度提高 采用重复计数 微孔清洁 取中段血样 鞘流技术 流式细胞计数原理 等先进技术 准确性提高 向5分类及鉴别幼稚细胞发展 现代血球仪的主要进展 加强全面质量管理 保证仪器检测的可靠性 具有智能化 可对同一病人诊断的前后进行对比 提出综合意见 确定诊断方向 更加注意保护操作人员的安全 自动进样 自动混匀 吸样针内 外自动清洗等 向流水线发展 将血球仪 网织红细胞计数仪 推片机 染色机联成流水操作线 多功能合成化流式细胞分析仪的某些功能合并到血细胞分析仪上 这样在进行常规血