Western Blot 实验试剂选购指南.doc

(一)蛋白质电泳1.请参照常规电泳操作.2.分子量标准:可选择普通分子量标准或预染的分子量标准.在选择预染的分子量标准时,要注意其优点和缺点:优点: 在电泳过程中可监控蛋白质分离状态; 可指示转印中蛋白质的转印效率.缺点: 染料影响蛋白质移动速度;分子量测定略欠精确;影响蛋白质与膜的结合力.购买信息:中范围蛋白质分子量标准(14.3-97.4KD)V5235S200g国产80元分子量大小:（14.3、21.5、31、40、42.7、55、66.2、97.4KD）中范围蛋白质分子量标准(24-97KD)MTB087-120次国产80元分子量大小:（24、36、53、66、97KD）低范围蛋白质分子量标准（6.5-66KD）M3913-120次Sigma280元低范围蛋白质分子量标准（6.5-66KD）M3913-1520次Sigma1198元分子量大小:（6.5、20、24、29、36、45、66KD）高范围蛋白质分子量标准（36-205KD)M3788-120次Sigma280元高范围蛋白质分子量标准（36-205KD)M3788-1520次Sigma1198元 分子量大小:（36、45、55、66、84、97、116、205KD）宽范围蛋白质分子量标准（6.5-205KD)M4038-120次Sigma280元宽范围蛋白质分子量标准（6.5-205KD)M4038-1520次Sigma1266元分子量大小:（6.5、14.2、20、24、29、36、45、55、66KD）预染的低范围蛋白质分子量标准(18-80KD)20次自产320元预染的低范围蛋白质分子量标准(18-80KD)50次自产680元分子量大小: 80, 60, 39, 23, 18 kDa预染的中高范围蛋白质分子量标准(20-210KD)20次自产320元预染的中高范围蛋白质分子量标准(20-210KD)50次自产680元分子量大小:210, 140, 106/102, 80, 52, 20 kDa预染的中高范围蛋白质分子量标准(18.3-210KD)2668148次Pierce1214元(二)蛋白质转印a)膜的选择:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比较如下:NC膜PVDF膜物理强度差好蛋白质结合能力80-100ug/cm2100-200ug/cm2溶剂耐受力无有考马斯亮兰染色否可以ECL检测稍差可以快速免疫检测否可以SDS存在下蛋白质结合差好质谱分析否可以(尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交)b)膜的大小: 请根据胶的面积来确定.c)膜的孔径: 0.45m适用一般蛋白质.0.2m适用小分子蛋白质.购买信息: 66485硝酸纤维素膜,0.45um,30cmX3m/卷美国Gelman1395元/卷硝酸纤维素膜,0.45um,20cmX20cm美国Gelman80元/张硝酸纤维素膜,0.45um,20cmX20cm国产30元/张60207尼龙膜, 0.45um,30cmX3m/卷美国Gelman2310元/卷尼龙膜, 0.45um,20cmX15cm美国Gelman90元/张尼龙膜, 0.45um,直径100mm,50张/盒国产260元/盒66543PVDF膜, 0.45um,30cmX3m/卷美国Gelman1690元/卷PVDF膜, 0.45um, 直径100mm,50张/盒国产260元/盒(三)蛋白质的显示(大部分实验不需要进行此步操作) 蛋白质染色的染料有很多种,各种的特点均不一样.蛋白质灵敏度影响免疫检测Ponceau-S Red丽春红5ug无快绿Fc5ug无Sypro Rose1-2ng无氨基黑10B1ug有考马斯亮兰R-250500ng有印度墨100ng有胶体金4ng有购买信息:Ponceau-S Red丽春红Sigma原装10g182元快绿FcAmresco分装25g258元氨基黑10BSigma分装10g168元考马斯亮兰R-250Amresco分装10g168元蛋白银染试剂盒自产MTB083-110次188元SDS-PAGE蛋白快速染色试剂自产25次100元Western Blot 膜可逆染色剂自产100ml100元(四)免疫检测有各种不同的免疫检测方法.请注意选择.方法不同,则所需的试剂也不同.如需方便,可选择完整的试剂盒.A.封闭膜:这一步会影响结果的成败和背景的强度.常用封闭剂为BSA和Tween20.脱脂干奶粉不适合用于糖蛋白和生物素标记抗体.购买信息: 牛血清白蛋白组份五BSAAmresco分装25g280元Tween 20Amresco分装500ml150元Western Blot 膜封闭剂自产100ml100元B.一抗: 根据目的蛋白质选择.单抗或多抗均可.注意已变性蛋白质无法检测,必须采用非变性胶电泳.我司有 R&D,Genex,Santa Cruz等公司的原装抗体或进口分装抗体.具体请参见免疫学部分产品-第一抗体.C.标记二抗: 根据一抗的来源选择二抗.购买信息: 请参见免疫学部分试剂-各种标记抗体D.底物系统: 采用常规底物或化学发光底物.(1)显色法: 常用底物为BCIP/NBT或DAB .此法简单,但灵敏度不高,并难以从膜上去除.(2)化学发光法: 目前比较常用的方法.灵敏度较高,检测时可采用X光胶片或CCD成像系统.不同显色方法产品比较如下:厂家灵敏度方法SuperSignal West Pico 化学发光底物 美国Pierce皮克级化学发光法SuperSignal West Dura 持久性化学发光底物 美国Pierce低飞克级化学发光法SuperSignal West Femto 高灵敏度化学发光底物 美国Pierce飞克级化学发光法ECL KitAmersham飞克级化学发光法BCIP/NBT (AP酶)100pg显色法DAB (HRP酶)100pg显色法推荐产品:SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液 采用独特的发光底物系统，是世界上最灵敏的ECL Western Blot 化学发光试剂。用于Western Blotting 条带的荧光发光，检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP 的抗体及其关联的抗原。由两种溶液组成，使用前混合。SuperECL Plus 超敏发光液，价格低廉，灵敏度大大高出Amersham 和Santa Cruz 公司同类ECL 产品100 倍以上，也明显高出Pierce 的SuperSignal West Pico 化学发光系统数倍，但背景更干净，发光时间持久，可以长达10 小时以上。特别适用于丰度极低而一般ECL 系统难于检测的目的蛋白。特点如下： 灵敏度极高，可检测10-100 fg 抗原。 高信噪比，背境干净。 发光迅速。 发光持续12小时以上。 可在日光灯下进行发光操作。 节省抗体(一抗1:20001:6000；二抗1:40001:10000)。 储存条件：4避光储存一年，偶尔室温放置数周不影响质量。购买信息产品名称规格编号价格SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液10mlP1010-1013825mlP1010-25266100mlP1010-100880美国Pierce公司化 学 发 光 底 物 系 列 SuperSignal 底物家族提供一系列的底物，适合免疫印迹的多种灵敏度要求。SuperSignal West Pico化学发光底物SuperSignal West Dura 持久性化学发光底物SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate更低检测极限(克)10-12 10-14 10-15 建议抗体稀释度一抗：1/1,000-1/5,000一抗：1/1,000-1/50,000一抗：1/5,000-1/100,000二抗：1/20,000-1/100,000二抗：1/20,000-1/250,000二抗：1/100,000-1/500,000信号持续时间6-8小时24小时8小时工作溶液稳定性室温24小时室温24小时室温8小时贮藏液存放时间室温1年室温1年室温6个月或4C一年推荐印迹膜硝化纤维硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDFSuperSignal West Pico 化学发光底物特征优点经济：比任何其它化学发光底物产品花费更少。更长发光时间：强光发射超过一个工作日，获得你想要曝光次数。高强度：信号比其它基于发光胺的系统强两倍。皮克级灵敏性：高度灵敏性可快速显色较宽水平范围内的蛋白质。优良的稳定性：24小时工作溶液稳定性；在运输条件环境下至少可稳定1年。SuperSignal West Dura 持久性化学发光底物特征优点24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底物提供的要长10倍；为发表质量的印迹提供更多的曝光极好的灵敏度：具前所未有的10-15 克级灵敏度节省抗体：使用Super Signal West Dura 伸展持续期底物比用其它化学发光底物，抗体稀释度可高得多。立即产生强烈信号，易被胶片或化学发光检测系统检测工作浓度至少稳定24小时；试剂盒在运输条件下可稳定至少一年SuperSignal West Femto 最高灵敏度化学发光底物特征优点释放由化学发光系统产生的最强信号；使胶片或图象仪系统成像更容易达到可能检测蛋白质的最低限：10-15 克经济：使宝贵的一抗稀释度可达1/100,000Lumi-PhosTM West Blotting 化学发光底物PIERCE 基于碱性磷酸酶检测系统的化学发光底物，其同时具有两个特色：高强度信号和较低的背景。定货信息 目录号 产品名称 包装 价格SuperSignal West Pico化学发光底物34080 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate 500ml 217834077 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate 100ml 64734079 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Trial Kit 50ml 383SuperSignal West Dura持久性化学发光底物34075 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate 100ml 364337071 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Trial Kit 20ml 805SuperSignal West Femto最高灵敏度化学发光底物34095 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 100ml 382834094 SuperSignal West Femto Maximum Substrate Trial kit 20ml 9504.Western Blotting检测试剂盒我们开发了此步免疫检测的完整的试剂盒,即HRP标记的二抗检测系统(含封闭液,洗液,底物,HRP/亲和素-二抗),您只需准备好一抗,并选择和一抗动物来源相应的试剂盒就可以.对于实验来说,采用完整的试剂盒可以避免各种试剂的不匹比而带来的结果不理想.Western Blotting DAB显色法检测试剂盒试剂盒的内容：（1）封闭试剂：10g蛋白质干粉2包。（2）浓缩抗体稀释液：20ml2瓶，为10倍浓缩液。（3）过氧化物酶标记二抗。1ml。效价1：200400 （4）DAB浓缩液10ml(40倍)购买信息: Western Blotting DAB显色kit（大鼠IgG）SA2023国产盒550元Western Blotting DAB显色kit（山羊IgG）SA2021国产盒550元Western Blot